1953年Racker等[1]首次在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)体内发现了转酮醇酶(Transketolase;EC2.2.1.1),随后人们陆续在其他生物体内也发现了转酮醇酶。目前的研究工作主要集中于大肠杆菌(Escherichiacoli)和S.cerevisiae的转酮醇酶,并且已经解决了相应基因的高表达问题。
1 转酮醇酶的特性及其作用机理
已发现的不同生物来源转酮醇酶大多为同型二聚体,只有少数几种为寡聚体或三聚体[2,3]。S.cerevisiae和E.coli的转酮醇酶都是典型的同型二聚体酶,拥有两个等同的催化活性中心。亚基分子质量在74kDa左右,两个亚基结合一分子的硫氨素焦磷酸(TPP)[2,4]。研究发现TPP和二价阳离子(如Mg2+、Ca2+)是转酮醇酶具备正常活性所必需的[1~6]。一些生物体内含有两种或三种转酮酶同功酶,如E.coli[7,8]和S.cerevisiae[9,10]都含有两种转酮醇酶。以E.coliK12为例,两种转酮醇酶(TKTA和TKTB)有74%的氨基酸同源性。其中TKTA是主要的同功酶,在所有已经测试的生长条件下TKTA的活性占到细胞总转酮醇酶活性的70%~90%[8]。S.cerevisiae也存在类似的情况,TKT1为主要的同功酶[10]。
在生物体内转酮醇酶参与戊糖磷酸途径(PP途径)中两个非氧化的反应(如图1所示),催化二碳单位(羟乙醛基,CH2OHCO-)在供体物质(酮糖)和受体物质(醛糖)之间进行可逆转移。它和转醛醇酶(催化的反应如图1所示)一起通过中间产物将PP途径和糖酵解途径联系起来,促使物质之间的相互转变[2,3,6]。不同生物来源的转酮醇酶对底物的要求差异很大。哺乳动物的转酮醇酶要求底物专一性高,只能利用少数几种磷酸化物质(如D-木酮糖-5-磷酸和D-果糖-6-磷酸)做供体[3]。E.coli、S.cerevisiae和菠菜的转酮醇酶要求底物专一性低,不仅能够利用磷酸化物质做供体而且能够利用一些非磷酸化的物质(如羟基丙酮酸和二羟丙酮)做供体[2,3,4]。研究发现除了不含有手性碳的羟基丙酮酸和二羟丙酮外,转酮醇酶的供体底物一般具有以下特征:可转移二碳单位,其C1位带有羟基,C2位为酮基;供体C3、C4为手性碳原子,且C3为S构型,C4为R构型,与C3和C4相连的羟基为反式结构[4]。
2 转酮醇酶在乙醇生产中的应用
木糖是半纤维素的主要组成成分,在植物纤维材料水解液中占30%左右,是仅次于葡萄糖的自然界最丰富的糖分。利用微生物发酵转化木糖生产乙醇是当前的研究热点之一。
自然界存在某些天然利用木糖的微生物,包括细菌、酵母和丝状真菌。真菌和细菌的代谢木糖的方式不尽相同,但都必需利用PP途径。酵母及丝状真菌的木糖代谢方式是经一系列酶(木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶)作用将木糖转化为D-木酮糖-5-磷酸,进入PP途径,然后再进行其它代谢[11]。细菌的木糖代谢途径也是经一系列酶(木糖异构酶、木酮糖激酶)的作用下将木糖转化为D-木酮糖-5-磷酸,进入PP途径,然后再进行其它代谢[12]。目前自然界发现的能够高效发酵乙醇的微生物(如S.cerevisia和Z.mobilis)都不能利用木糖,而能利用木糖的微生物(如毕赤酵母Pichiastipitis和E.coli)不能有效地进行乙醇发酵。因此有必要对微生物进行基因工程改造。
为了使S.cerevisia能利用木糖发酵,一些科研人员将P.stipitis的木糖还原酶基因(xyl1)和木糖脱氢酶基因(xyl2)导入S.cerevisia。得到的重组菌株虽然可以利用木糖,但不能发酵生产乙醇。木糖主要被还原成木糖醇以及其它副产物[13,14]。推测这是由于木糖环节上存在障碍,其中PP途径最有可能。Wood利用代谢通量分析等手段发现在许多生物体内转酮醇酶和转醛醇酶是PP途径的关键酶[15],因此提高体内转酮醇酶和转醛醇酶的活力可以提高PP途径的代谢活力,进而可以提高微生物的发酵效率。S.cerevisia含有这两种酶,但酶活力较低。因此试图将tkt1和tal1克隆到酵母多拷贝载体中。Walfridsson等[16]报告,高表达xyl1、xyl2、tkt1和tal1等基因,可以加强S.cerevisia对木糖的利用,但木糖消耗的增加主要表现在木糖醇得率的提高,依然没有乙醇生成。为了解决木糖醇累积问题,鲍晓明等人[17]通过调节S.cerevisia体内木糖还原酶与木糖脱氢酶的比活力以及超表达tkt1、tal1,使得乙醇得率有所提高,而木糖醇无积累。Walfridsson和鲍晓明[18]还构建了表达嗜热细菌ThermusthermophilusxylA和超表达P.stipitistkt1、tal1的S.cerevisia工程菌,已表明能利用木糖发酵产生乙醇。
自20世纪80年代,科研人员就开始尝试构建能够利用木糖生产乙醇的运动发酵单胞菌工程菌,但收效甚微。发现Z.mobilis体内转酮醇酶活性很低且没有测出转醛醇酶活性,这说明Z.mobilis缺乏一个完整的PP途径。ZhangMin等人为了完善Z.mobilis的PP途径以及促使木糖转化为乙醇,在Z.mobilis中转入并表达了E.coli的xylA(木糖异构酶基因)、xylB(木酮糖激酶基因)、tktA(转酮醇酶基因)和talB(转醛醇酶基因),使得Z.mobilis能够通过PP途径以及ED途径将木糖发酵成乙醇。由此获得的重组菌株CP4株能够发酵木糖,产醇率达到理论值的84%[12]。采用类似的方法,他们通过在Z.mobilis中转入并表达了E.coli的araA(阿拉伯糖异构酶基因)、araB(核酮糖激酶基因)、araD(核酮糖差向异构酶)、tktA(转酮醇酶基因)和talB(转醛醇酶基因),构建了能利用阿拉伯糖发酵产乙醇的Z.mobilis工程菌。由此得到的工程菌可以利用阿拉伯糖发酵,产醇率也达到理论值的84%[19]。他们还通过基因同源重组技术将tktA、talB和其它木糖、阿拉伯糖代谢所需基因整合进入Z.mobilis染色体,构建了能够同时利用葡萄糖、木糖和阿拉伯糖发酵产乙醇的工程菌,产醇率达到理论值的83%[20]。
3 转酮醇酶在芳香族氨基酸生产中的应用
在细菌中,转酮醇酶参与戊糖代谢,催化合成D-核糖-5-磷酸和D-赤藓糖-4-磷酸。其中D-核糖-磷酸是核苷酸和组氨酸生物合成前体,而D-赤藓糖-4-磷酸是莽草酸、芳香族氨基酸、芳香族维生素以及维生素B6的生物合成前体[2,5,6]。因此工业生产中常利用转酮醇酶生产芳香族氨基酸。
早在上个世纪70年代,人们就开始研究如何利用葡萄糖生物合成芳香族氨基酸[21]。芳香族氨基酸中的色氨酸和苯丙氨酸还是人类营养不可缺少的必需氨基酸。芳香族氨基酸也是重要的有机合成原料,可用来合成许多物质。如L-苯丙氨酸可以通过化学方法合成人工增甜剂-天冬氨酰苯丙氨酸甲酯,而通过构建合适的大场杆菌工程菌可以将L-色氨酸和L2酪氨酸转化为染料靛蓝和紫外吸收物质真黑素[3,22]。
长期以来,研究人员通过提高3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合酶的催化活性以及表达量来提高葡萄糖转化为芳香族氨基酸的转化率DAHP合酶是芳香族氨基酸合成途径的启动酶,也是该途径所特有的酶[23]。研究表明各种提高DAHP合酶催化活性的措施都能提高葡萄糖转化为芳香族化合物的转化率。与关注DHAP合酶催化活性相反,研究人员较少地关注芳香族氨基酸生物合成途径的小分子限制物。芳香族氨基酸生物合成途径一个重要的限制物就是D-赤藓酮糖4-磷酸,而D-赤藓酮糖4-磷酸由PP途径提供。Draths等[22]对E.coliPP途径转酮醇酶在芳香族化合物生产的关键作用进行了系统研究。研究发现转酮醇酶是决定D-赤藓酮糖4-磷酸浓度的限制酶。如果降低转酮醇酶的活性就会导致芳香族氨基酸产量的下降。他们的研究进一步表明当体内DAHP合酶的活性达到一定水平后即使再增加活性也不提高芳香族氨基酸的合成水平。如果此时在体内增加转酮醇酶的表达量,则会大幅度地增加葡萄糖等物质转化为芳香族氨基酸的量。
Ikeda等[24]采用基因文库的方法克隆得到了含有谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium.glutamicum)tkt基因的DNA片段,并用遗传学的方法验证了所得片段确实含有tkt基因。分别用低、中、高拷贝的质粒扩增tkt基因,转酮醇酶的表达量与tkt基因拷贝数成正比。将这些质粒导入生产芳香族氨基酸和赖氨酸的C.glutamicum工程菌中,发现高表达转酮醇酶会增加芳香族氨基酸的产量(增加5%~20%),而赖氨酸的产量却会有所下降。他们认为高表达的转酮醇酶会重新调整进入PP途径的糖酵解代谢中间物的量,增加芳香族氨基酸合成前体D-赤藓酮糖4-磷酸含量,同时减少了赖氨酸合成前体天冬氨酸的含量。
Berry等[25]试图通过改造色氨酸代谢途径等措施使得E.coli工程菌能够利用葡萄糖发酵生产靛青,但得到的菌株只能产生预期量一半的靛青。他们对该菌株进行了分析,发现DAHP合酶受到了中间代谢物的严重抑制。于是在高表达DAHP合酶、失活丙酮酸激酶同功酶的同时,通过高表达转酮醇酶为DAHP提供更多的底物,从而减轻了中间代谢物对DAHP的抑制作用。这样得到的菌株靛青产率提高了60%。
4 转酮醇酶在有机合成中的应用
由于固有的识别手性物质构型的功能,酶已越来越广泛地用于一些特定构型的手性物质的分离与合成。由于糖含有多个手性碳原子,因此能为化学合成提供大量的手性片段。但是由于糖类分子中有较多的官能团,如果以糖为原料进行化学合成,就必须要考虑使用保护基团来防止各种不期望发生的反应[26]。转酮醇酶能够催化糖类等物质二碳单位的转移,从而实现C-C的断裂和形成,便于合成新的化合物。目前这种酶促合成方法已广泛用于化学合成领域[26,27,28,29]。
转酮醇酶催化的反应既是立体选择性的也是立体定向性的。立体定向性是指产物中形成的新的手性中心必是(S)-构型的,而立体选择性是指转酮醇酶对手性物质的某一构型具有偏好[29]。由于转酮醇酶只能以2(R)-A-羟基醛为受体,因此该酶可以识别外消旋物质并合成单一构型的加合产物[26,27,29]。如果以羟基丙酮酸(HPA)为转酮醇酶供体,由于反应过程中能释放出二氧化碳,因此该反应过程不可逆[3,26,27,29]。菠菜、S.cerevisia和E.coli的转酮醇酶都能以HPA为供体。其中E.coli转酮醇酶催化HPA的活性为60U/mg,而菠菜和S.cerevisia转酮醇酶的活性分别只有2U/mg和9U/mg[26]。而且E.coli转酮醇酶对溶剂也有较大的忍受力[28],因此E.coli转酮醇酶与菠菜和S.cerevisia转酮醇酶相比更适于大规模生产。
目前食品添加剂的价格很高,因此开发生物催化剂生产天然分子制备调味剂和香味剂很有前景。菠菜的转酮醇酶已用于6-脱氧-L-山梨糖的酶促合成。6-脱氧-L-山梨糖是呋喃醇的前体,而呋喃醇是用于食品工业的具有焦糖味的物质。反应物HPA是由菠菜的丝氨酸乙醛酸氨基转移酶催化L-丝氨酸得到的,而另一反应物4-脱氧-L-苏阿糖是由4-脱氧-L-赤藓酮糖经弯曲杆菌(Corynebacteriumequi)或液化沙雷氏菌(Serratialiquefyaciens)细胞异构化得到的。最后HPA和4-脱氧-L-苏阿糖在菠菜转酮醇酶的催化下生成6-脱氧-L-山梨糖,产率最高可达35%[30]。
D-木酮糖5-磷酸是转酮醇酶酶活分析的最佳试剂,也是研究肝脏组织糖酵解途径的重要物质。Zimmermann等人[31]利用果糖1,6-二磷酸醛缩酶和转酮醇酶制备D-木酮糖5-磷酸。首先,D-果糖-1,6-二磷酸在果糖1,6-二磷酸醛缩酶的催化下断裂成磷酸二羟丙酮和D-甘油醛3-磷酸,而后两者在磷酸丙糖异构酶(TPI)的作用相互转化达到平衡。D-甘油醛3-磷酸和HPA在E.coli转酮醇酶的催化下生成木酮糖5-磷酸,产量可达克级,总转化率可达82%。
一些带有放射性标记的磷酸化物质是研究生物代谢途径和物质合成途径的重要物质。Demuynck等人[32]用菠菜转酮醇酶催化3-13C标记的HPA和D-甘油醛合成了[1,2-13C2]-木酮糖。Floss等[33]用转酮醇酶催化D-[5-14C,3H]核糖5-磷酸和3-13C-HPA合成了13C、14C和3H标记的D-景天庚酮糖7-磷酸和D-艾杜-庚酮糖7-磷酸。其共同的反应物3-13C-HPA都是由L-[3-13C]丝氨酸经丙氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶催化制得的[32,33]。
聚羟丁酸盐(PHB)是重要的能源储存物质,其生物合成途径中间代谢物乙酰辅酶A和NADPH的供应量是PHB生物合成的重要影响因素。Ralstonia eutropha以葡萄糖酸酯为碳源通过ED和PP途径合成PHB及相应聚酯。PP途径的氧化反应部分产生NADPH,非氧化反应部分产生甘油醛-3-磷酸(乙酰辅酶A合成前体)。高表达的转酮醇酶不仅可以产生合成所需的足量的甘油醛3-磷酸,伴随产生的NADPH,而且能够增加与PHB生物合成直接相关酶的活力。因此高表达转酮醇酶不仅明显地提高了PHB的生成量而且提高细胞的生长速度[34]。
此外,转酮醇酶还在其它物质的合成中起着重要的作用。DAHP是细菌、真菌和植物莽草酸途径的重要中间物,其类似物可以破坏植物芳香族氨基酸的合成,因此可以用作除草剂。Crestia等人[35]开发了能够生产几乎所有DAHP类似物的酶促合成方法,其关键步骤之一就是转酮醇酶催化C5~C6键的形成。羟基吡硌烷类化合物已被证实为许多糖苷酶的抑制物,Humphery等人[36]开发了合成该类物质的酶促方法,该方法的关键步骤之一就是转酮醇酶催化(=)3-O-甘油醛和HPA生成5-O-苄基-D-木酮糖。
底物浓度过高会严重降低转酮醇酶的转化数,这是限制转酮醇酶化学酶合成大规模工业应用的一个主要问题。此外,产物浓度过高也会抑制转酮醇酶的活力。为了解决以上问题,科研人员尝试了多种方法。Wandrey等人[37]开发了膜反应器系统,Vasic2Rack等人[38]开发了错流反应器系统,Chauhan等人[39]开发了产物原位移除技术,均取得了较为理想的效果。
5 转酮醇酶缺陷在工业上的应用
研究发现有时转酮醇酶的高表达会造成产物的减产,而转酮醇酶的缺陷反而会造成产物的增产。一个典型的例子就是发酵法生产D-核糖。生产D-核糖的微生物系转酮醇酶或D-核酮糖-5-磷酸-3-差相异构酶(RPE)缺陷型。在含有葡萄糖的培养基中培养,这些菌株能通过PP途径将葡萄糖部分转化。在转酮醇酶转化点处,D-核糖-5-磷酸积累,它脱磷酸成D-核糖分泌于培养基中,并解除此中间体的反馈抑制。丧失转酮醇酶突变株产生D-核糖,而丧失RPE的突变株在积累D-核糖的同时,分泌D-核酮糖。因此作为D-核糖生产菌株,以转酮醇酶缺陷型突变株为宜[40]。
Kamada等[41]研究了产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)工程菌株中转酮醇酶的表达对肌苷和黄苷酸生产的影响。与野生型相比,含有tkt基因的高拷贝质粒使得C.ammoniagenes工程菌体内的转酮醇酶活力增加了10倍,但产物量却下降了10%~20%。与之相反,采用定点诱变造成转酮醇酶的完全失活后,产物量却增加了10%~30%。这表明转酮醇酶会促使D-核糖-5-磷酸重新进入糖酵解途径,如果破坏了这条途径就会使得细胞重新调整体内的碳流量,将原本应该进入PP途径的代谢中间物改道进入嘌呤核苷酸的合成途径。
6 小结
目前已经实现了多种生物来源转酮醇酶基因的高表达,因而产生了大量的转酮醇酶,这使得对该酶进行工业应用成为可能。目前该酶已用于工业生产的多个领域,如乙醇生产,芳香族氨基酸和手性化合物的生物合成等。近年来有关转酮醇酶的研究日益增多,相信随着研究的持续深入以及生物工程技术的充分利用,转酮醇酶工业应用前景将会更广阔。
