河北农业大学动物科技学院/宋海彬 赵国先 李娜 马可为
摘要 葡萄糖氧化酶是一种新型饲料添加剂，一般由霉菌发酵法制得，它具有与其它酶制剂不同的作用模式。此文介绍了葡萄糖氧化酶的生产及其在畜牧生产上的应用，分析了其在动物体内的作用机理。
关键词 葡萄糖氧化酶；生产应用；作用机理
安全、优质是现代畜牧业生产的核心，在经过瘦肉精、苏丹红等一系列事件以及长期以来对抗生素添加剂的争论，这一主题更显突出。近些年来，众多绿色添加剂被开发，如益生素、益生元、酸制剂、酶制剂、植物提取物等等。酶制剂具有安全、无毒副作用、无残留、不污染环境等特点。因此，作为替代抗生素的新型饲料添加剂，在畜牧生产中得到广泛应用。
葡萄糖氧化酶（GOD）是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢，在有过氧化氢酶存在的情况下，生成葡萄糖酸和水，并在此过程中消耗氧气。经旋光测定，GOD反应的最初产物不是葡萄糖酸，而是中间产物δ-葡萄糖酸内酯，而后δ-葡萄糖酸内酯以非酶促反应自发水解为葡萄糖酸。
早在1904年人们就发现了GOD，但没有引起足够的重视。1928年Muller首先从黑曲霉的无细胞提取液中发现GOD。Kusai（1960）等、Pazur和Swobod-da（1964）分别从青霉素和黑曲霉中提纯GOD。Petruccioli（1995）等用青霉素的突变株生产出GOD。我国自1986年开始研究GOD的制备提纯工艺，1998年正式投入生产，1999年农业部将其定为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一。
1 葡萄糖氧化酶（GOD）的特性
高纯度葡萄糖氧化酶为淡黄色粉末，易溶于水，分子量为150000D左右，最大光吸收波长为377nm和455nm。葡萄糖氧化酶的作用温度为30～60℃，固体酶制剂在0℃下保存至少可稳定2年，在-15℃下可稳定8年。葡萄糖氧化酶稳定的pH范围为4.0～8.0，具有很好的稳定性。Ag＋、Hg＋、亚硫酸氢钠对酶有强烈的抑制作用，而Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋对酶具有不同程度的激活作用。
2 葡萄糖氧化酶的生产
2.1葡萄糖氧化酶的生产菌种
葡萄糖氧化酶的生产采用霉菌发酵法，一般采用曲霉和青霉做为生产菌种。生产上使用的菌株必须是安全无毒的，如黑曲霉、米曲霉、青霉、乳酸克鲁维酵母和脆壁克鲁维酵母是公认的安全菌株，经过多次试验未发生过中毒现象，是工业生产GOD的普遍酶原。杨慧英等（1998）[1]应用经多次筛选培育的黑曲霉菌株ZBY-7进行发酵培养，得到含有较高活力GOD。王志新等（2006）[2]应用黑曲霉A9进行发酵，并进行提取纯化，得到分子量为138200Da、pH稳定范围较宽，而且热稳定性很好的葡萄糖氧化酶纯酶。用基因工程的其他方法构建更优良的生产葡萄糖氧化酶的微生物也一直受到各国科学家的重视[3][4]。母敬郁等（2006）[5]利用公认的生产分泌蛋白质最高的工业微生物之一，瑞士木菌（Trichode rmarees），通过同源重组葡萄糖氧化酶基因表达了重组的黑曲霉葡萄糖氧化酶。
1974年葡萄糖氧化酶协作组筛选得到1株点青霉，其发酵水平为15～18u/ml，经过多年研究及不断筛选，研究人员得到了一些高产菌株，使发酵水平得到不断提高[6][7]。胡常英等（2006）[8]以产葡萄糖氧化酶的点青霉（Penicillium notatum）No.8312为出发菌株，经紫外线诱变处理，对单菌落进行摇瓶选育，在193个突变株中初筛选定3株，进一步对培养基和发酵条件优化试验，复筛得到了一株高产葡萄糖氧化酶的菌株，连续12次对其传代试验，该突变株遗传性状稳定，摇瓶产酶水平达到55.7u/ml，比出发株（36.27u/ml）提高了53.9%。
2.2 发酵工艺的优化
在发酵工艺上，对不同碳源的选择、对发酵适宜工艺条件的优化等方面也做出了很多的研究工作。江洁等（1996）[9]通过试验确定自选青霉菌株发酵生产的适宜条件为：培养基初糖浓度为8%、消毒前pH7.7、灭菌条件为10磅15min、消泡剂以豆油为，以此条件进行发酵，菌株最高产酶为96.7u/ml。杨慧英等[1]通过实验证明，黑曲霉发酵培养时间为42h时胞内GOD酶活最高，培养温度在开始15～20h固定在30～35℃，以后降至30～31℃，产葡萄糖氧化酶量最高，产酶量将增加3～4倍。在培养过程中，由于不溶性CaCO3是霉菌的生长载体，在葡萄糖酸发酵及GOD合成中，添加不同量CaCO3进行产酶研究，结果发现随CaCO3浓度的增大，GOD活性增加；当CaCO3浓度高于35g/l时，菌体受到抑制。
2.3葡萄糖氧化酶的提取、纯化
葡萄糖氧化酶可以用很多种方法进行提纯，如沉淀法、吸附法、离子交换法、亲和色谱及结晶法等。
沉淀法即选择合适的沉淀剂通过分级沉淀或一步沉淀将葡萄糖氧化酶与其它蛋白质分开。沉淀剂一般有乙醇、丙酮、硫酸铵、单宁酸等。
吸附法是在一定条件下，吸附材料的活性基团与葡萄糖氧化酶通过疏水相互作用而被吸附，而后通过改变缓冲液的浓度和pH值使其与吸附剂解吸附。
离子交换法，根据不同酶等电点的不同，通过离子交换剂来进行纯化。葡萄氧化酶经过离子交换后的酶蛋白比活得到了很大的提高，提纯葡萄糖氧化酶的离子交换剂常用DEAE-纤维素和DEAE-葡聚糖凝胶A-50。
近年来发展起来的反向胶束法（RM），在分离提纯酶方面越来越表现它的优势。杨慧英等（1998）[10]研究了应用RM提取葡萄糖氧化酶的方法，并对温度、pH值、表面活性剂类型和浓度、有机溶剂、震荡时间、静止时间、离子强度、低级醇的加入和相比等条件进行了探索。
3 在畜牧生产中的应用
尽管葡萄糖氧化酶的研究和生产已经过了几十年的历程，但目前对GOD的研究报道主要集中在其应用于血糖的测定，在食品中用于啤酒、果汁等的脱氧保鲜以及改善面粉质量等等。农业部在1999就将葡萄糖氧化酶作为允许使用的饲料酶制剂添加剂之一，其在动物生产及饲料保存方面有一定的使用效果。
李焰（2004）[11]报道，在AA肉鸡的基础日粮中添加0.15％饲用葡萄糖氧化酶制剂，以基础日粮为对照组进行为期40d的饲养试验。结果表明：饲用葡萄糖氧化酶能显著提高AA肉鸡的生产性能、饲料转化率、抗病能力和成活率。
河北省农科院（1997）临床观察表明，葡萄糖氧化酶可以解除饲料中真菌毒素的危害，提高动物免疫能力，替代药物促生长剂使用。张晓云（2006）[12]的试验研究发现在产蛋鸡日粮中添加葡萄糖氧化酶可以促进乳酸杆菌增殖、抑制大肠杆菌增殖、提高血清白蛋白水平。赵国先（2007）[13]报道，为期6周的海兰褐蛋鸡饲养试验，0.3%和0.4%GOD添加组显著提高了饲料转化率（P<0.05）；GOD添加组显著降低了死淘率，且以0.3%和0.4%添加组效果最明显（P<0.01）；0.2%GOD添加组获得最高经济效益（P<0.05）。赵国先（2006）[14]报道，海兰褐蛋鸡日粮中添加0.3%～0.4%GOD能显著降低蛋黄中胆固醇含量，以0.4%添加组效果最明显（P<0.01），0.3%的添加量显著提高了蛋壳厚度，并且添加GOD显著提高了蛋壳厚度、哈氏单位和蛋比重，但各试验组间蛋形指数、蛋黄颜色、蛋黄相对重和蛋壳相对重差异不显著（P>0.05）。
在饲料保存上，GOD也有很好的效果，吕进宏（2004）[15]报道，加有GOD的青贮饲料对长膘的牛有利，其原因是GOD可以消耗青贮的氧气，提高青贮物内的缺氧程度，有利于厌氧性乳酸菌的增殖，加快了乳酸菌的发酵过程，迅速产生大量乳酸，使青贮的pH值很快下降，抑制了有害细菌的繁殖，避免了异常发酵，最终保证青贮质量。
4 葡萄糖氧化酶的作用机理
葡萄糖氧化酶作为一种新型的绿色添加剂有其独特的作用方式，与普通酶制剂不同，它并不是通过改善营养素的消化利用和减轻抗营养因子的方式来改善对动物生产性能的影响。其方式可能是一方面通过与饲料中葡萄糖作用而产生的葡萄糖酸来发挥作用，另一方面，葡萄糖氧化酶在与葡萄糖作用过程中消耗O2，使消化道更易形成厌氧环境，促使厌氧有益菌的增殖。综合起来，葡萄糖氧化酶通过在肠道中的作用而可能起到酸化剂和益生菌的作用。
葡萄糖酸是一种有机酸，它能够降低肠道pH值，提高饲料的酸结合力，增殖有益菌，抑制有害菌，并且低的pH值可以促进肠道蠕动，提高营养物质的利用率。G.Biage等（2006）[16]通过体外和体内试验报道了葡萄糖酸在仔猪上的应用，体外试验显示，经过4、8、24h的发酵试验，盲肠液中的氨显著减少；发酵24h后，总脂肪酸、乙酸、丙酸、n-丁酸、乙酸丙酸比、乙酸+丁酸与丙酸比都极显著的增加。饲养试验结果表明，与对照组相比，添加3000ppm和6000ppm的葡萄糖酸使仔猪的平均日增重分别提高了13%和14%，并且葡萄糖酸增加了空肠的总短链脂肪酸量。即葡萄糖酸可以改仔猪肠道健康状态，提高其生产性能。葡萄糖酸能够到达大肠，刺激乳酸菌的生长，Takamitsu和Tsukahara等（2002）[17]应用葡萄糖酸及与其有相似结构的山梨醇和葡萄糖研究了葡萄糖酸的发酵模式，结果显示，葡萄糖酸较后两者发酵慢，其主要被乳酸菌所发酵并且刺激丁酸盐的产生，葡萄糖酸可能会像益生元一样发挥作用。葡萄糖酸具有类益生元的性质，在小肠中很少被吸收，但当它到达肠道后段时，能够被那里栖息的菌群所利用，生成丁酸。丁酸是一种短链脂肪酸（SCFA），SCFA能快速被大肠粘膜吸收，为大肠上皮细胞提供能量，其中丁酸又是对刺激肠上皮细胞生长、促进钠和水吸收效率效果最好的SCFA，而且众多报道证实丁酸盐能够抑制肠癌[18][19]。因此，葡萄糖酸除了发挥酸化剂的作用外，可能还通过其在肠道后段的发酵产物——n-丁酸而发挥更为重要的作用。
葡萄糖氧化酶在作用过程中消耗氧气，由于大部分肠道病原菌都是耗氧菌，大部分有益微生物都是厌氧菌或兼性厌氧菌，因此葡萄糖氧化酶在肠道中消耗氧气有助于增殖有益菌，抑制有害菌，达到维持肠道菌群平衡，保证动物健康。
5 小结
对于葡萄糖氧化酶的研究已经历了几十年的历程，但其主要应用于食品及检测行业中，在养殖业中尽管有一些应用的报道，支持其作为一种新型的饲料添加剂应用于动物生产及饲料保存，但对其发挥作用的机理研究较少，限制了其广泛的应用。因此，今后除了从动物种类进一步加强对其应用的效果研究，更应当从其作用机理方面着重进行探讨。另一方面，应当结合饲料生产及动物自身情况来开发适用于动物生产的葡萄糖氧化酶制剂。
