木聚糖酶固态发酵条件的优化

1 材料与方法

1.1 菌 株

宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）B-2木聚糖酶高产菌株，由山东宝来利来生物工程股份有限公司研究院筛选获得并保藏。

1.2 原料和试剂

麸皮、玉米芯粉、棉粕、啤酒糟粉碎后备用；

桦木木聚糖和木糖均购于Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯或化学纯。

1.3 主要仪器

FA1004电子天平；电热恒温培养箱；UV-2000紫外分光光度计；电热恒温水域锅；高压灭菌锅；高速万能粉碎机。

1.4 培养基及培养方法

1.4.1 斜面培养基 PDA培养基，接种B-2菌种后于30℃培养84h，用于保存菌种和斜面种子等。

1.4.2 麸曲种子培养基 向250mL三角瓶中加10g麸皮，料水比为1：0.9，pH值自然，121℃灭菌30min，接种B-2斜面种子，于30℃培养72h，期间每12h翻曲一次。

1.4.3 固体发酵培养基 向500mL三角瓶中加20g发酵物料，料水比为1：0.9，pH值自然，121℃灭菌30 min；接种0.5％的 B-2三角瓶种子，于30℃培养36h，期间翻曲1次（第20 h）。

注：在优化试验中，均为20料/500mL三角瓶。

1.5 酶活测定

1.5.1 木聚糖酶酶活的定义 1g固体酶制剂在50℃，pH值4.6的条件下，每分钟水解木聚糖释放出1μmol木糖的酶解能力，即一个酶活力单位，以U表示。

1.5.2 原理 木聚糖在木聚糖酶的作用下，水解产生还原糖（以木糖表示），还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在540nm波长下，测定吸光度A，吸光度与酶活力成正比。

2 结果与讨论

2.1 培养基组分配比对产酶的影响

采用单因素正交试验进行培养基原料的筛选，设计了4因素、3水平的正交表，见表1和表2。

表1 因素水平　　　　　　　

表2 正交试验结果

从表2可以看出因素水平的优先级为：C2>D3>A2>B2；结果显示玉米芯和棉粕的影响最大，可见培养基中的玉米芯所含有的木聚糖成分有利于诱导木聚糖酶的产生。所以初步确定发酵配方为：玉米芯50%、麸皮40%、棉粕10%、啤酒糟5%，但考虑到啤酒糟在实际生产中采购比较困难（特别是在冬季）及麸皮对木聚糖酶的影响，综合考虑，发酵配方初步确定为玉米芯50%、麸皮40%、棉粕10%。

2.2.2 氮源对产酶的影响 由于棉粕的价格比较高，所以以玉米芯50%、麸皮40%为基础培养基进行氮源的筛选。在含氮量相等的条件下，分别向培养基中添加2%的(NH 4)2SO4（以干料计，下同）和其他几种常见无机氮源，并以添加棉粕的培养基为对照，研究不同氮源对产酶的影响，结果见表3。

表3 氮源对产酶的影响

从表3可以看出，在含氮量相等的条件下，添加棉粕和硫酸铵、尿素组酶活较高，且差别不大。考虑到成本因素，采用硫酸铵和尿素作为氮源；为了确定硫酸铵和尿素的最佳比例，固定玉米芯50%、麸皮50%为碳源，硫酸铵和尿素各设3个水平做正交试验，见表4、表5。

表4 因素水平

表5 正交试验

从表5可以看出，影响因素A>B，得出最佳比例为硫酸铵2%、尿素3%，即配方4酶活最高，所以确定发酵培养基为：玉米芯50%、麸皮50%、硫酸铵2%，尿素3%。

2.2.3 发酵温度对产酶的影响 发酵温度对产酶的影响见表6。从表6可以看出，在24℃至30℃范围内随着发酵温度的升高，酶活显著提高，当发酵温度为30℃时，木聚糖酶达到8823U；继续提高发酵温度，酶活差异不显著，但发酵温度过高，会加剧发酵过程中的水分蒸发，并易造成细菌的污染，因此，选择30℃为发酵温度。

表6 发酵温度对产酶的影响

2.2.4 培养基料水比对产酶的影响 培养基中料水比对产酶的影响见表7。从表7可以看出，当料水比为1：1.2时，木聚糖酶达到最大值，与其他料水比条件下的酶活相比，差异较明显。因此，确定料水比为1：1.2。

表7 料水比对产酶的影响

2.2.5 固态发酵的产酶进程 在优化条件下，研究了菌株固态发酵产酶过程，结果见图1。从图1可以看出，接种后12h内即可检测到木聚糖酶活，24h后木聚糖酶活逐渐升高，在36h左右出现第一个酶活高峰，到48h左右出现最高峰之后下降，而且水分损失严重，孢子生成逐渐增多，容易造成粉碎时孢子的污染。根据这个特点在大规模生产时可以选择第一个高峰期时采收，将有利于降低生产成本。

3 结论

3.1 黑曲霉 B-2以农业副产品玉米芯、麸皮为营养原料，能够产生具有很高活性的木聚糖酶，因此可用其发酵曲作为饲料添加剂。

3.2 黑曲霉B-2以玉米芯、麸皮为复合碳源时，木聚糖酶活性较高，因为麸皮既为碳源又含有黑曲霉B-2生长所必需的营养物质，玉米芯中木聚糖的存在形式有利于诱导木聚糖酶的产生，两者是黑曲霉B-2产生高活性木聚糖酶的必备因素，缺一不可。

3.3 通过三角瓶固态发酵对黑曲霉B-2产木聚糖酶的各种因素进行了研究，结果表明：发酵最佳培养基为玉米芯50%、麸皮50%、硫酸铵2%，尿素3%，发酵温度为30℃，料水比1：1.2，自然 pH值，培养48h，发酵期间翻曲2次（20ｈ和36ｈ），木聚糖酶可以达到8500U左右。

山东宝来利来生物工程股份有限公司/徐海燕 张志焱 谷 巍 曹 斌

摘 要　

关键词 木聚糖酶；正交试验；固态发酵

目前，用于生产木聚糖酶的菌种主要是木霉属和曲霉属，但木霉发酵过程中易产生毒素，限制了其在食品、饲料等领域的应用。黑曲霉是公认的安全菌种，国外已实现黑曲霉木聚糖酶的工业化生产。本试验对1株高产木聚糖酶的宇佐美曲霉 B-2菌株的三角瓶固态发酵培养基及发酵条件进行研究，旨在为木聚糖酶的低成本工业化生产奠定基础。