几丁质酶在很多方面都有着重要的应用。自然界尤其是在海洋,每年生成的几丁质以百亿吨计,是储量仅次于纤维素的天然聚合物。将几丁质经几丁质酶酶解得到的几丁寡糖用于医疗保健具有降血脂、血糖和抗肿瘤等活性[1,2];用作植物生长物质,能刺激植物产生植保素,诱导病程相关蛋白等,提高植物抗病抗逆性[3,4]。几丁质酶还可以作为增效剂与生物农药一起施用,显著提高防治植物病虫害的效果[5]。目前,用于生产几丁质酶的菌株产酶活力不高,尚未进行几丁质酶的工业化生产。
笔者实验室筛选出一株产几丁质酶活力较高的菌株链霉菌A048,并对其酶学性质及一步发酵产酶最适条件进行了研究[6,7],将其几丁质酶用于苏云菌杆菌杀虫剂增效剂防治烟青虫、玉米螟,取得了良好的效果。本文报道的是应用二步发酵、共固定化发酵等工艺进一步提高链霉菌A048产几丁质酶活力的实验结果。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种:链霉菌(Streptomycessp )A048,由河南农业大学微生物实验室提供。
1.1.2 斜面菌种培养基:采用高氏一号培养基。
1.1.3 完全培养基:葡萄糖5g,蛋白胨5g,酵母浸出膏5g,K2HPO40.5g,MgSO40.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,水定容至1.000mL,pH7.2～7.3。每250mL三角瓶装量50mL,8层沙布扎口。
1.1.4 发酵产酶培养基:K2HPO40.5g,MgSO40.5g,KCl0.5g,FeSO4·7H2O0.01g,NH4NO34g,几丁质粉20g,水定容至1.000mL,pH7.2～7.3。每250mL三角瓶装量50mL,8层沙布扎口。
1.2 方法
1.2.1 用于二步发酵和共固定化发酵的链霉菌A048菌丝体制备:在装有完全培养基的三角瓶中接种一环链霉菌A048斜面孢子,于28℃下振荡180r/min培养适当时间,将发酵液2.000r/min离心20min收集菌丝体,用无菌水洗涤两次离心备用。
1.2.2 链霉菌A048菌丝体和几丁质共固定化:将每个摇瓶培养收集到的菌丝体和75mL含有1g几丁质细粉的2%海藻酸钠溶液相混合,充分搅拌均匀后,用注射器逐滴滴加于150mmol/L的CaCl2溶液中,得到玻璃珠状共固定化球。
1.2.3 几丁质酶活力测定:按Imoto(1971)的方法[8]:取0.5mL酶液加入1.5mL1%的胶体几丁质溶液,在40℃水浴中温浴20min,然后加入4mL铁氰化钾溶液,在100℃水浴中显色10min。离心或过滤后用分光光度计在420nm波长下测其吸光度。
酶活力单位定义为:在pH值为6.0、40℃条件下每分钟水解胶体几丁质产1μmolN 乙酰葡萄糖胺的酶量为一个酶活力单位。
2 结果与分析
2.1 链霉菌A048产几丁质酶二步发酵工艺
2.1.1 链霉菌A048在完全培养基中的生长曲线:为了制备适当菌龄和菌丝量的菌丝体用于二步发酵和共固定化发酵,首先测定了链霉菌A048在完全培养基中的生长曲线,结果见图1。从图1可见,链霉菌A048在0～12h菌丝生长量较少,处于延迟期;培养12～30h菌丝增加迅速,为对数生长期;之后,进入稳定期(30～36h)和衰亡期(36～48h)。
2.1.2 链霉菌A048产几丁质酶二步发酵工艺:将每瓶培养24h、30h和36h制备的菌丝体分别接入一瓶产酶发酵培养基中,28℃下180r/min振荡培养,间隔6h取样测定几丁质酶活力。每个处理重复3次。培养不同时间制备的菌丝体接入产酶发酵培养基中,培养24h均到达产酶高峰,产酶活力最高的是培养30h制备的菌丝体,其次是培养36h制备的菌丝体,培养24h制备的菌丝体产酶活力最低(见图2)。原因可能是培养24h制备的菌丝体量偏少,而培养36h制备的菌丝体菌丝量多,但生活力有所下降,产酶量低于培养30h的菌丝体。
2.2 链酶菌A048菌丝体与几丁质共固定化产酶发酵工艺
将培养30h菌龄的链霉菌A048菌丝体与几丁质共固定化得到的球接入产酶发酵培养基中,28℃、180r/min振荡培养,每隔6h取样测定几丁质酶活力。结果表明,培养至36h产酶达到最高峰(见图3)。
2.3 二步发酵工艺、共固定发酵工艺与一步发酵工艺的比较
其它条件保持相同,进行链霉菌A048产几丁质酶一步发酵、二步发酵和共固定化发酵,分别在各个发酵方法的产酶高峰期,一步发酵工艺于120h、二步发酵工艺于发酵24h和共固定化发酵于36h测酶活力,对此3种工艺的产酶活力进行比较。共固定发酵工艺产酶活力为4.74U/mL,比一步发酵工艺高1.8倍。二步发酵工艺产酶活力为3.64U/mL,比一步发酵工艺高1.1倍。共固定发酵工艺酶活力尽管较高,但距达到实际生产水平仍有较大的差距。
2.4 几丁质和纤维素双诱导产酶二步发酵工艺
在二步发酵工艺中添加几丁质的同时添加0.2%纤维素作为另一诱导物,接种制备的链酶菌A048的菌丝体进行产酶发酵,与仅添加几丁质作为诱导物相比,产酶高峰由后者的24h延至第48h,产酶活力提高48.01%(见图4)。进一步实验比较了纤维素不同添加量对链霉菌A048产几丁质酶的影响。添加0.4%的纤维素几丁质酶活力最高,酶活力达18.52U/mL,比不添加纤维素提高4倍,其次是添加0.6%的纤维素,酶活力为16.24U/mL,比不添加纤维素提高3.4倍(见图5)。
3 讨论
彭仁旺等[9]报道,将球孢白僵菌进行二步发酵工艺生产几丁质酶,几丁质酶产量比一步发酵工艺提高数十倍。认为二步发酵工艺既能使菌丝体生长良好,又能使几丁质酶被充分诱导。我们的研究发现,将链霉菌A048在完全培养基中培养至对数生长末期,离心洗涤收集菌丝体,然后接种入发酵产酶培养基中,进行二步发酵工艺生产几丁质酶,几丁质酶活力比一步发酵工艺提高1.1倍,发酵周期共54h,比一步发酵工艺缩短66h。表明不论是球孢白僵菌,还是链霉菌A048,几丁质酶合成的动力学类型均属于非生长偶联产物形成,几丁质酶的产量只与菌丝量有关。二步发酵工艺生产周期短,几丁质酶活力高,表现出良好的实际应用前景,但几丁质酶活力提高仅1.1倍,有待进一步提高。
为了解决诱导物是不溶解性的诱导酶的连续或半连续生产,Vasseur[10]把细胞和不溶解底物共固定,运用共固定化技术,进行小单孢菌几丁质酶的生产,酶活力比非固定化游离系统高得多。我们的研究表明,把链霉菌A048的菌丝体与几丁质粉共固定化,接入发酵产酶培养基中培养36h,几丁质酶活力比一步发酵工艺提高1.8倍,发酵周期缩短54h。但需要解决的问题是,由于几丁质粉颗粒较大,制成的固定化球直径比较大,影响了球内菌丝体的供氧和酶的分泌,有待进一步研究。
几丁质酶是诱导酶,几丁质是有效的诱导物。研究表明,几丁质酶的诱导是从头合成的,要经过转录、翻译的过程。所以,提高几丁质酶的产量,需提高几丁质酶基因的表达量。Margolles Clark等[11]将里氏木霉(Trichodermareesei)的纤维素酶基因的高效启动子cbh1与哈茨木霉(Trichodermaharzianum)的几丁质酶基因相连,转入哈茨木霉,在含纤维素的培养基中,几丁质酶活力比非转化子高10倍,而非转化子亦有基本水平的几丁质酶活力。说明几丁质酶的表达仅与启动子的表达效率有关,纤维素亦能诱导哈茨木霉非转化子产生几丁质酶。
Pedraza Reyes等[12]指出,由于几丁质和纤维素在组成结构上有很大的相似性,所以,几丁质酶和纤维素酶也表现出相当高的序列同源性,如它们的底物结合结构域很相似。但这两种酶基因的启动子序列是否有高的同源性,尚未见报道。我们的研究结果表明,采用几丁质和纤维素双因子诱导二步发酵,链霉菌A048产生的几丁质酶活力比只加几丁质诱导可提高4倍,其原因有待进一步探讨。
