海洋是生命的起源;占地球总面积的70%;具有高盐、高压、低温、低光照、寡营养等特点;90%的海水平均温度为5℃或更低,深海的温度一般为3℃±1℃,海洋是世界上最大冷藏厢。由海洋嗜冷菌和海洋耐冷菌产生的低温酶具有以下3个方面生物学特性:①低温高催化效率;②高效结构柔顺性;③热不稳定性。使其在应用上比中温酶、高温酶更有优势;在农业、环境、食品加工、添加剂等领域蕴藏巨大的应用潜力。据推测海洋微生物可达0.1～2亿种,但被人们认识的还不足1%,由于海洋低温酶分布广泛性、生物学多样性和广泛应用性已经成为21世纪世界各国研究的热点,英、美、法、日等国海洋低温酶的研究已经取得长足发展,而我国有关低温酶的研究起步较晚、相关的研究报道较少[1,2]。本文是针对渤海和黄海微生物分布为研究对象,意在开发海洋低温微生物酶制剂,本文就海洋低温蛋白酶生产菌株最适发酵条件方面的研究结果作以报道。
1 材料与方法
1.1 菌种 Pa040523菌株,大连大学生物工程学院从渤海和黄海分离选育。
1.2 培养基和培养方法
1.2.1 斜面培养基:牛肉膏蛋白胨培养基。
1.2.2 种子培养基:葡萄糖11g,尿素4g,磷酸氢二钾1g,玉米浆26g,定容至1L。
1.2.3 发酵培养基:玉米淀粉糖18g,尿素6g,磷酸氢二钾6g,磷酸二氢钾3g,定容至1L。
1.2.4 培养方法:在100mL三角瓶中,装入30mL种子培养基,接入斜面菌种,10℃培养48h,作为液体种子。在500mL三角瓶中,装入120mL发酵产蛋白酶的培养基,10℃培养3d,取培养液4,000r/min离心,上清液即为蛋白酶粗酶液,测定蛋白酶活性。
1.3 分析方法
1.3.1 蛋白酶活性测定方法:Folin 酚法测定酶活。
1.3.2 生物量测定:100mL发酵液,4,000r/min离心20min,蒸馏水清洗2次,60℃烘干,称重。
2 结果与分析
2.1 培养液起始pH值对Pa040523菌株低温蛋白酶产量的影响调整发酵培养基的起始pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0,Pa040523菌株低温蛋白酶液体发酵,结果见图1。
实验结果表明(图1),pH值达到5.5时,低温蛋白酶产量达到最大值982.5U/mg;当pH值再增加,低温蛋白酶产量开始下降。
2.2 培养时间对Pa040523菌株低温蛋白酶产量的影响在优化条件下,研究了培养时间对Pa040523菌株低温蛋白酶产量的影响,实验结果见图2。
实验结果表明,随培养时间增加,Pa040523菌株低温蛋白酶产量增加;当培养时间达到72h时,Pa040523菌株低温蛋白酶产量达到最大值1.149.6U/mg;当培养时间再增加时,低温蛋白酶产量略有下降。
2.3 培养温度对Pa040523菌株低温蛋白酶产量的影响
对Pa040523菌株低温蛋白酶发酵温度进行研究,实验结果见图3。
实验结果(图3)表明,培养温度为12℃时,Pa040523菌株液体低温蛋白酶发酵产量达到最大值1,498.2U/mg。因此,确定Pa040523菌株低温蛋白酶液体发酵最适温度为12℃。
2.4 接种量对Pa040523菌株低温蛋白酶产量的影响接种量对发酵产量影响较大。接种量对Pa040523菌株低温蛋白酶液体发酵影响,实验结果见图4。
由图4可以看出,当接种量达到7%时,Pa040523菌株低温蛋白酶产量达到最大值1,646.8U/mg。
2.5 通气量对Pa040523菌株低温蛋白酶产量的影响
在500mL三角瓶中装入不同体积的发酵液,考察通气量对Pa040523菌株低温蛋白酶液体发酵影响,实验结果见图5。
由图5可以看出,当装液量达到170mL时,通气量能满足Pa040523菌株需要,低温蛋白酶产量达到最大值1,732.6U/mg。
2.6 Pa040523菌株低温蛋白酶发酵
按发酵培养基[3]、发酵条件优化后的条件,进行Pa040523菌株低温蛋白酶50L发酵放大实验,发酵罐内装30L发酵培养基,4MHCl自动流加控制pH值5.5,发酵72h。Pa040523菌株50L低温蛋白酶发酵,酶产量为1,976.2U/mg。
3 讨论
蛋白酶是一类重要的工业用酶,已广泛用于食品、洗涤、皮革、饲料等领域。目前应用的蛋白酶主要为中温蛋白酶,酶的最适作用温度一般在50℃左右[4]。然而低温蛋白酶的研究始于70年代,主要倾向于低温碱性蛋白酶和低温中性蛋白酶的研究,有关低温酸性蛋白酶研究较少[5,6]。由于低温蛋白酶有着接近自然环境温度的最适反应温度,对热敏感等特点,使其具有中、高温蛋白酶无法取代的优越性,使其在食品、化妆、废物处理、皮革、饲料等领域具有广泛的应用前景[7,8]。虽然低温蛋白酶在许多领域有着比中、高温蛋白酶更好的应用前景,但由于低温蛋白酶的研究起步较晚,还没有得到象中温蛋白酶那么广泛与深入的研究,因此目前在工业上的应用还有很多空白处。国外如日本、美国等国家,低温蛋白酶己被用于洗涤、食品等行业[5,7]。目前低温蛋白酶的研究己经引起世界各国学者们的关注。随着对低温蛋白酶研究的深入,将会有更多行业应用低温蛋白酶。经多年研究实践表明,本文报道的Pa040523菌株低温蛋白酶酶产量虽然不是处于国内外的领先水平,但Pa040523菌株生长和培养条件要求粗放,是一株很有生产潜力的菌株。
