摘要：米曲霉(Aspergdlus orywe) FS0179产。一淀粉酶固体发酵优化结果表明:最佳有机碳源为玉米粉，最佳有机氮源为花饼粉;培养基正交试验表明最佳培养基配方为:花生饼粉20%，玉米粉5%，无机盐为c组配方;初始发酵pH为7.4;最适的发酵温度为33T;在以上最适条件下固体培养6d，发酵产酶水平可达1300.6u/g，优化结果比初始设计提高了42.9%。该酶酶学特性研究表明:该酶作用的最适温度为55cC;最适作用声为4.0; Fee十、Ba十、CU 21、 NIW I . Fe3+金属离子对酶具较强抑制作用，而Ca'对酶具有一定激活作用。
关键词:a一淀粉酶;米曲霉;固体发酵
Studies on Solid-state Fermentation Conditions of
α-amylase from Aspergillus oryzae FSO179
Qi Shibin
(Anhui Uniliversity of Technology And Science BT department,
Abstrac:The solid一state fermentation conditions of producing a一amylase from Aspergillus ayzae FSN65 were studied.These included the carbonand nitrogen choice,the culture medium composition,the initial pH，the fermentation temperature and the fermentation period. The resultsindicated that when being the optimum medium andfermentation conditions, the activity of a一amylase producedby FSO179 could reach 1300.6u/g,increasing 42.9% contrasted to the initial. The studies of the characteristics of this a一amylase showed that the optimum temperature is 55℃,the optimum pH is 4.0,the stability pH is from 3.5 to 6.0.Fee2+，Ba2+，Cu2+，Mn2+ and Fe3+ showed stronginhibition for this enzyme, butCa2+ showed a little activation.
Key words: a一amylase; Aspergillus oryzae ; solid fermentation
a一淀粉酶[EC.3.2.1.1]是一种重要的酶制剂，广泛应用于发酵、食品、饲料、医药、造纸及纺织工业，其产量几乎占全部酶制剂产量的50%以上[1-3]。尤其来源于真菌的a-淀粉酶因其安全性及优良酶学特性可以改善面团的发酵特性和面包的贮藏特性，被开发为一种重要面包品质改良剂闭，成为。a一淀粉酶的最有前景用途。目前国内主要是利用细菌生产。a一淀粉酶，真菌发酵生产a一淀粉酶的较少。本文报道拟用高安全性真菌菌种— 米曲霉(Aspergillus oryzae) FS0179固体发酵a一淀粉酶的研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌种:米曲霉(Aspergillus oryzae) FS0179菌株由本实验室保藏。
1.1.2 固体发酵培养基
初始设计培养基配方(%):固体原料:熬皮80，豆饼粉10,玉米淀粉10;液体原料:K2HPO4, 2, (NH4 )2S04 4;固液比为1:1;初始PH自然;灭菌条件:121 ℃ , 30min。
1.2 方法
1.2.1酶活测定方法
根据QB/T 1803一93测定方法，酶活定义:1g固体酶粉于60℃ , pH6.0条件下，lmin液化lmg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以u表示。
2 结果与分析
2.1 产酶培养基的优化
在综合相关文献的基础上，初步设计了米曲霉FS0179固体发酵初始产酶培养基及初始产酶条件，产酶水平达到910.3u/g。在此基础上进行了产酶培养基及产酶条件的优化研究。
2.1.1 碳源种类及浓度对产酶的影响
分别用9种碳源进行单因素碳源对产酶影响的试验，结果见表1。结果表明采用单糖、双糖作为碳源，产酶量不如淀粉类的多聚糖，这可能多聚糖类的碳源对产酶具有一定诱导效应，其中以玉米粉的效果最好。我们以玉米粉作为碳源，改
变培养基中的玉米粉的含量，研究玉米粉添加量对产酶的影响，结果见图1。结果表明:提高培养基中的玉米粉含量反而不利于产酶，本试验的最佳添加量为1岁1飞固形物原料，同时为培养基成分的正交试验提供了设计依据。
表1 不同碳源种类对固体发酵a一淀粉酶的影响
Tabble 1 Effect of carbon sources on the a一amylase yield
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碳源种类 酶活(u/g) 相对酶活(%) |
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葡萄糖 1184.7 88.0 蔗糖 1136.0 84.3 麦芽糖 1178.3 87.5 乳糖 1212.3 90.0 柠檬酸 1071.7 87.0 小麦淀粉 1193.3 88.6 玉米粉 1347.0 100.0 玉米淀粉 1201.3 89.2 可溶性淀粉 1232.0 91.5 |
2.1.2 氮源种类及浓度对产酶的影响
改变培养基中有机氮源的种类，选择工业中最常用的三种有氮源:蛋白陈、黄豆饼粉和花生饼粉，研究对产酶的影响，结果见表2。结果表明:采用花生饼粉效果最理想，比初始设计选用黄豆饼粉酶活提高近15%。因此采用花生饼粉作为氮源，改变培养基中花生饼粉的含量，研究花生饼粉添加量对产酶的影响，结果如图2，在添加量为1一2g/10g固形物原料时，产酶结果都比较理想，同时也为培养基成分的正交试验提供了设计依据。
表2 不同氮源种类对固体发酵a一淀粉酶的影响
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氮源种类 酶活(u/g) 相对酶活(%) |
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蛋白胨 1396.2 87.7 豆饼粉 1359.2 85.4 花生饼粉 1591.7 100.0 |
2.1.3 培养基配方正交实验结果
在确定了最佳碳源和最佳氮源之后，为了进一步了解碳源(玉米粉)、氮源(花生饼粉)及无机离子间的相互关系，通过三因素三水平的正交实验以确定最佳培养基配方，其中无机离子组设计了a,b,c组。结果见表3及图3，结果表明最佳培
养基配方为:花生饼粉20%，玉米粉5%，无机盐c组配方。
表3 培养基配方正交实验结果
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序号 A花生饼粉(%) B玉米粉(%) C无机盐配方组 酶活(u/g) |
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1 10 5 a 1129.0 2 10 10 b 1181.0 3 10 15 c 1182.7 4 20 5 b 1211.3 5 20 10 c 1232.0 6 20 15 a 1195.3 7 30 5 c 1234.7 8 30 10 a 1221.7 9 30 15 b 1178.3 |
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K1 3492.7 3575.0 3546.0 K3 3634.7 3556.3 3649.4 |
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K1 1164.2 1191.7 1182.0 K3 1211.6 1185.4 1216.3 |
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R 48.7 26.2 34.3 |
2.3.1初始pH对产酶的影响
改变培养基中初始pH,培养70h，测定酶活，结果如图3。结果表明:该菌株产酶的最适初始PH为7.4，与初始设计自然pH(pH6.0)有了较大的变化。
2.3.2 培养温度对产酶的影响
将该菌株在不同温度下培养产酶，结果如图5，温度低，生长缓慢，发酵周期延长，而温度较高时，生长速度快，发酵周期缩短，但酶活明显下降，最佳发酵温度33℃。
2.3.3 发酵周期对产酶的影响
用以上最佳培养基及最适条件下，研究固体发酵时间对菌株产酶的影响，定时取样测定酶活，结果见图6，在前期产酶量上升的速度较快，到第5d产酶量上升趋缓，第6d产酶量达到最高峰为1300.6u/g，发酵条件优化的结果比初始设计条件下产酶水平提高42.9%，取得较理想的结果。
图6 发酵周期对产酶的影响
2.4 米曲霉a一淀粉酶酶学特性的研究
2.4.1 a一淀粉酶的最适作用温度
在30一60℃的不同温度、pH6.0条件下测定同一酶液的酶活力，结果如图7。结果表明:该酶作用的最适温度是55℃，在45一55℃的范围内都保持着相当的酶活力(70%以上的相对酶活力)。
2.4.2 a一淀粉酶作用的最适作用pH
在不同pH缓冲液体系、在55℃条件下测定酶活力，结果如图8。结果表明:该酶作用最适pH为4.0，在3.5一6.0的酸性区域保持相对较高的酶活力，因此该酶是酸性a一淀粉酶。
图7 温度对a淀粉酶活性的
2.2.3 金属离子对a一淀粉酶活性的影响
在反应体系中分别加人1ml浓度为lmmol/L的各种金属离子，研究金属离子对a一淀粉酶活性的影响，结果如表4。结果表明:Ca+对酶有一定的激活作用，而其它Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+、Cu2+有较强的抑制作用，抑制率可达50%.
表4 不同金属离子对a一淀粉酶活性的影响
3讨论
a一淀粉酶近几年来作为面粉添加剂被广泛应用，其来源安全性引起人们重视。国内早期开发a一淀粉酶主要来源来自细菌，其安全性与酶学特性限制其在食品工作中的应用。本研究采用米曲霉(Aspergillus oryzae)进行α一淀粉酶固体发酵，其酶源安全性与酶学特性结果都适用于面粉用酶改良剂。同时发现该菌株固体发酵要比液体发酵产酶水平较高，这跟国外报道结果相一致，这可能是淀粉在固态下更易诱发米曲霉产生a一淀粉。此外该菌株如果进一步选育还有更大产酶潜力。
参考文献:
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[3]邓静，吴华昌.a一淀粉酶固态发酵的研究〔J].四川轻化工学院学报，2000,13(2):55一57.
[4」蔡静平，张晓云，黄淑霞，等.以黑曲霉生产面包品质改良复合酶的研究「J].食品与发酵工业，2002,28(8):37一42.
