脂肪酶催化的研究进展

脂肪酶催化的研究进展

刘书来

(郑州工程学院，河南郑州 450052)

? 摘 要 本文简单介绍了脂肪酶的立体结构和催化机理，综述了非水相的有机溶剂体系中脂肪酶催化的特点与性质，并对微水的无溶剂体系、微乳液体系和超临界体系进行了简单的论述。定向进化技术有助于改善酶的催化特点和应用范围，酶交联晶体的制备和生物印迹方法的采用对提高脂肪酶的活性、热稳定性和选择性也有较大的促进作用。

关键词 脂肪酶 非水相 定向进化 交联酶晶体 生物印迹

?中图分类号 Q 814 文献标识码 A 文章编号 1009-4725(2003)04-0010-0016-05

Advance in Lipase Catalysis

Liu Shulai

(Zhengzhou Institute of Technology,Zhengzhou,450052)

Abstract The structure and catalytic mechanism of lipase was presented briefly. The characteristics of lipase in the non-aqueous system(including solvent-free system, reverse-phase micelle and supercritical fluid) were discussed. Directed evolution will improve the catalytic properties and broaden the range of its application. Cross-linked enzyme crystal and imprinting of lipase will be helpful for its catalytic activity, thermal stability and stereoselectivity.

Key words lipase nonaqueous directed evolution Cross-linked enzyme crystal biology imprinting

脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)全称为甘油三酰酯水解酶，其基本功能是催化甘油酯水解为甘油和脂肪酸，另外，其它大分子和小分子的酯、硫羟酸酯、酰胺类化合物、多元醇酯、多元酸酯等也可作为脂肪酶所催化反应的底物［1］。脂肪酶广泛存在于动物肝脏、植物种子和微生物中［2］。微生物脂肪酶具有较高的催化活性和稳定性，易于生产，是商品脂肪酶的主要来源，另外，来源于猪胰脏的胰脂酶也有较好的专一性［3］。

1 脂肪酶的结构与催化机理

与传统化学催化剂相比，脂肪酶所催化的反应具有更加优越的特点。酶反应具有高催化活性和较强的专一性与选择性，反应的副产物少，在较温和的条件下进行反应，耗能少，设备投资小，对环境无污染，产品质量好［4］。

不同类型的脂肪酶具有非常相似的立体结构。脂肪酶的氨基酸顺序可能有较大的差别，但却具有相似的折叠方式和活性中心。一般地，脂肪酶的多肽链折叠成两个结构域，即N-末端和C-末端结构域。N-末端的活性部位有一条可结合长链脂肪酸的疏水性的通道，该通道从催化部位的Ser直到分子的表面［5］。几乎所有的脂肪酶的活性部位都有组氨酸(His)、色氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)组成［16］。但也有一些学者认为活性部位的氨基酸序列为His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly (Gly为甘氨酸，X、Y、Z、W为其他氨基酸)［6］。通常情况下，脂肪酶的活性部位被一个螺旋片段(又称为“盖子”)所包住。在底物(如醇、酸或酯等)存在的情况下，酶的构象发生变化，“盖子”打开，含有活性部位的疏水部分就暴露出来。“盖子”中α-螺旋的双亲性会影响脂肪酶与底物在油/水界面的结合能力，其双亲性的减弱将导致脂肪酶活性的降低。“盖子”的外表面相对亲水，而其面向催化部位的内表面则相对疏水。由于脂肪酶与油/水界面的缔合作用，使盖子张开，活性部位得以暴露，这使得底物与脂肪酶的结合能力增强，此时底物就容易进入疏水性的通道而与活性部位结合，形成酶-底物复合物［7］。

与其它水解酶不同，脂肪酶只有在油/水才能被活化。关于脂肪酶在油/水界面的酯交换反应的机理有多种模型，其中以乒乓机制较为合理［5］(见图1)。脂肪酶最早应用于油脂工业是油脂的水解生产脂肪酸［8］。随着非水相酶学研究的深入开展，以及对脂肪酶的热力学和和动力学的研究发现［9］：脂肪酶不仅可以催化酯的水解反应，而且在一定的反应体系中，控制适当的反应条件，也可以催化酯合成反应，这就为非水相酶学的研究奠定了理论基础。

图1 油脂酯交换反应过程中脂肪酶在油水界面被活化的示意图

?2 脂肪酶的固定化与商业化

目前，商品化的脂肪酶已经有20种以上，固定化的脂肪酶由于其较好的热稳定性和便于重复利用，并有利于节约生产成本，在实际生产中有较为广泛的应用。同其他酶类一样，脂肪酶的固定化也可采用吸附法、交联法、共价法、包埋法。采用分子沉积法进行酶分子的自组装，成为酶固定化的一种新技术。经聚乙二醇、糖脂等修饰的脂肪酶，其催化活性和稳定性得到改善，这也拓展了脂肪酶的应用范围。

脂肪酶的固定化载体有硅藻土、DEAE-Sephadex、氧化铝、硅胶、多孔玻璃、高岭土、膨润土、离子交换树脂、CM-纤维素、DEAE-纤维素、胶原、聚丙烯酰胺等。几家大的酶制剂公司如Amano、Sigma、Novo等均提供脂肪酶(见表1)。诺维信公司的Lipozyme系列酶是将来源于微生物Mucor miehei的脂肪酶采用吸附法固定在离子交换树脂上的一种较为广泛应用的商品酶。

表1 商品化脂肪酶的来源

3 非水相体系中的脂肪酶催化反应

非水相酶学的研究在最近20多年里取得了长足的发展，脂肪酶所应用的反应体系也有了较大的改善。这主要集中在有机相中的酶催化反应，还有微水条件下的无溶剂体系、微乳液体系和超临界流体介质。

在有机溶剂体系中脂肪酶的催化反应可以获得许多其他常规条件下所无法比拟的优势［9］：(1)改善了传统水解酶的应用范围，可以催化酯交换、酯化、氨解等合成反应的进行；(2)可进行水不溶性物质的催化转化，大大拓展了酶的作用底物范围；(3)由于脂肪酶不溶于有机溶剂，这就为反应终止后酶的回收和重复利用提供了可能与便利；(4)有机溶剂的使用还为反应过程及分离过程降低了能耗；(5)酶的热稳定性有了较大的提高；(6)减少或防止了由于水所引起的副反应；(7)避免长期反应造成的微生物污染。

有机溶剂的种类很多，理化性质选择的余地大，容易操作。近年来手性药物在有机溶剂中的酶促拆分与合成的研究热点集中在酶的催化活性和选择性。有机相中酶催化反应主要受有机相含水量和溶剂极性的影响。此外还受温度和pH值的影响。有机溶剂中酶的催化作用，水仍然是必需的基本条件。酶蛋白分子周围紧密结合着的一层水，称为必需水。在绝对无水的体系中，酶不表现催化活性。一般认为，蛋白质分子折叠的结果使暴露在溶剂(水溶液)中的疏水基团减少到最低限度，这样蛋白质分子表面就有较多的亲水基团和带电基团，水就通过和这些亲水基团形成氢键相互作用吸附在蛋白质的表面。对保持酶的自然(活性)构象起着平衡和稳定的作用，同时屏蔽了蛋白质表面极性基团之间的相互作用，使酶分子在水中具有一定的柔性［10］。柔性的增加意味着底物靠近酶分子和产物离开酶分子的过程中受到的阻力减小，酶的催化活性增加。但酶分子保持一定的刚性结构非常重要。由于结构的刚性，酶在有机溶剂中能保持(记忆)进入有机相前的构象，这种构象使酶分子保持高度的催化专一性和活力。必需水的含量与溶剂的极性也有直接的关系。疏水的非极性溶剂不容易夺取酶分子周围的必需水、含有必需水的酶在这类介质中比较稳定。极性溶剂易与酶争夺必需水，但当增加水的含量，酶也可以在极性较大的溶剂中保持一定的活力。

反应体系的含水量也会对酶的含水量产生影响［11］。在许多情况下，为了促使酯合成反应的进行，有必要除去反应所生成的水，可以采用全蒸发、冷阱、分子筛或通入氮气来实现。目前，含水量主要采用直接加水于反应体系或酶，或者采用水合盐与固定化酶在密闭体系中达到平衡。有时，体系的含水也采用水合盐对的水活度法来控制。另有研究表明，在反应体系中除加入水外，加入其它添加剂，如甘油、多羟基化合物，也可以提高酯交换反应的速度。

脂肪酶的活性稳定性的研究对酶的工业活性应用有非常重要的意义。Shimada等在研究油脂酯交换制备功能性油脂的过程中发现［12］：酶活性的降低并不是由于结合于固定化酶上水的失去所致。这样，在酶使用过程中，酶上过量的水为“干"底物所除去，并逐渐降至临界含水量，而后酶的含水量很难受底物的变化，同样地，酶的水含量也很难使体系的含水量发生变化。关于每一种脂肪酶的临界含水量的详细说明还没有文献报道。溶剂的极性对酶的催化活力也有较大的影响。一般认为酶在非极性溶剂中的活力较高［13］。采用疏水性参数LogP可以定量的描述溶剂的极性。一般地，LogP越大，溶剂的疏水性越强，酶的活力越大。

酶的选择性是多方面的，包括底物专一性、对映体选择性、前手性选择性和位置选择性等，对药物的拆分与合成起决定作用的是能识别对映体的对映体选择性。酶在两个底物之间的选择性通常定义为专一性常数之比，这样对映体选择性就可以表示为(Kcat/Km)R/(Kcat/Km)S, Kcat和Km分别表示酶的转换数和米氏常数［14］。显然对映体选择性越高，产物的光学纯度越高，对手性药物的拆分越有利。酶的对映体选择性受溶剂性质的显著影响，可以通过改变溶剂种类的方式来改变酶的对映体选择性。关于溶剂是怎样影响酶选择性的，这个问题目前内没有充分、准确、清楚的解释。有的影响可以用溶剂的某些性质(如疏水性参数LogP)并通过底物、酶和溶剂的相互作用来解释。

在溶剂体系下的酶催化反应，由于有机溶剂的使用又造成环境污染，使产品后处理过程更加复杂，对产品的安全性也不利。尝试采用其他的反应介质来取代有机溶剂是绿色合成的追求目标。

微乳液体系一般由表面活性剂、表面活性助剂、油、水等组成，它是一种热力学稳定、光学透明、宏观均匀而微观不均匀的体系，能提供脂肪酶催化所需的巨大油/水界面［42］。脂肪酶增溶于油包水(W/O)微溶液中的纳米级“水池”中，可使脂肪酶以分子的形式扩散，这与生物体内的细胞微环境极为相似［15］。但该体系的制备较为复杂，且酶的活性难以保持，酶的重复利用困难。

采用不加任何溶剂和表面活性剂的无溶剂体系可避免溶剂体系和微乳液体系的不足，产品的后处理简单，环境污染小，满足产品和生产的安全性，对酶的活性和选择性影响不大，同时，由于没有溶剂等的稀释作用，底物浓度较高，反应速度快［16］。但在该体系下，反应混合物粘度大，往往需要较高的温度，这是其不利的一面。尽管如此，无溶剂体系在油脂酯交换制备结构脂方面仍具有非常广泛的应用。

超临界条件下的酶催化反应是酶催化的新领域之一，由于在超临界状态下，底物的性质和传质都发生了较大的变化，而酶在该状态下的活性、稳定性及专一性是否发生改变等，是目前极为关心的问题［17］。关于超临界二氧化碳下的脂肪酶催化的酯交换反应的研究已取得了一定的进展，更深入的研究也在逐步展开。

4 脂肪酶的体外定向进化

采用蛋白质工程的手段对酶进行结构上的改造，可以大大提高酶的活性并有效地改善其选择性。酶分子蕴藏着巨大的进化潜力是酶的体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化(directed evolution of enzyme in vitro),又称实验分子进化(experimentally molecular evolution),属于蛋白质的非合理设计(irrational design)，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制［18］，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组、自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。

体外定向进化技术是在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用Taq DNA多聚酶不具有3′→5′校对功能的性质，配合适当的条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶，从而排除其他突变体。简言之，定向进化=随机突变+选择［19］。随机突变的方法主要有易错PCR(error-prone PCR)、DNA改组(DNA shuffling)、外显子改组(exon shulling)、杂交酶(hybrid enzyme)、交错延伸(stagger extension process)、酶法体外随机-定位诱变(random site-directed mutagensis),然后采用平板初选，再配合活性染色法(activity staining)和X-光片消化分析(X-ray film digestion assay)等可筛选出需要的突变株［20］。P. aeruginosa野生型脂肪酶基因的定向进化过程包括诱变、缺陷株的表达、筛选、酶的活性分析、突变株的确认等五个过程［21］。

5 脂肪酶分子的生物印迹

Russell等［22］提出了生物印迹的修饰方法。其基本过程为：将醇溶于含有其配体(通常为其底物或底物类似物或竞争性抑制剂)的缓冲溶液中，使其构象发生改变，而有利于与其底物结合，再将此酶液冷冻干燥形成酶粉，用有机溶剂(常为无水乙氰)冲洗冻干酶粉除去配体后，将其过滤并真空干燥，在无水或微水有机溶剂中，由于酶的记忆功能，这种新构象仍能保持，致使结合配体的能力大大提高。此法的基本原理是酶在有机溶剂中具有刚性构象，但在水中，印迹效应即消失，印迹酶在有机溶剂中对新构象的记忆时间相当长(可达几周)。

Dabulis等［23］用L-苹果酸作配体印迹BSA与溶菌酶，效果类似，但在不同溶剂条件下，印迹的BSA对苹果酸的结合能力差异较大，而且，这种结合能力与溶剂的LogP值、介电常数、偶极矩都无系统相关性，却与溶剂的氢键参数有很好的相关性，即溶剂作为氢键受体的倾向越大，印迹酶在该溶剂中与配体的结合能力越小，不同的酶与同一配体的结合能力与同一酶对不同配体的结合能力都不同。Okahata等［24］以脂肪酶作催化剂，以R-1-苯乙醇与月桂酸的酯化反应为模型反应，研究了印迹与表面活性剂相结合对提高酶活性的效果。其结果表明，印迹可极大地提高脂肪酶的对映选择性。

6 酶晶体的交联

自从Richard等于1964年首次用戊二醛交联羧肽酶A的晶体，对交联酶晶体(cross-linked enzyme crystal)的研究一直受到研究者的关注。Lalonde等［25］将交联的脂肪酶晶体用于十几种手性酯的拆分，发现酶的对映选择性大大提高，不仅如此，交联酶还具有其他优点：(1)既不溶于水也不溶于有机溶剂；(2)回收方便；(3)稳定性比游离酶高2～3个数量级；(4)大孔结构使溶剂、底物和产物的扩散阻力小。

Jim Lalonge对Candida rugosa脂肪酶(CRL)的交联酶晶体的催化特性和理化选择性能的研究发现，其催化选择性水解拆分α-取代羧酸及仲醇的选择性比CRL的粗酶制剂提高了3～50倍；在水溶液中的稳定性由5 h提高至13天；在水/水互溶的有机溶剂混合物中的稳定性提高300～3000倍［9］。

收稿日期：2003-2-8

参考文献

［1］ Gandhi N N. Applications of Lipase［J］. J. Am. Oil Chem. Soc., 1997, 74(6): 621-634

［2］ 谷利伟, 赵金兰. 酶技术在油脂工业中的应用［J］. 中国油脂, 1998, 23(5): 43-45

［3］ 张树政. 酶制剂工业(上册)［M］. 北京：科学出版社，1984，350-383

［4］ Xu X, Fomuso L B, Akoh C C. Synthesis of Structured Triacylglycerols by Lipase- Catalyzed Acidolysis in a Packed Bed Bioreactor［J］. J. Agric. Food Chem., 2000, 48(1): 3-10

［5］ Lee K T, Akoh C C. Structured Lipids: Synthesis and Applications［J］. Food Rev. Int., 1998, 14(1): 17-34

［6］ Balcao V M, Paiva A L, Malcata F X. Bioreactors with Immobilized Lipase: State of Art［J］. Enzyme Microb. Technol., 1996, 18(6): 392-416

［7］ Yahya A R M, Anderson W A, Moo-Young M. Ester Synthesis in Lipase- Catalyzed Reactions［J］.Enzyme Microb. Technol.,1998, 23(7-8): 438-450

［8］ 顾文玲. 脂肪酶油脂水解技术的研究及进展［J］. 西部粮油科技, 1998, 23(6): 31-35

［9］ 袁勤生.现代酶学［M］. 上海：华东理工大学出版社

［10］ Dordic J S. Designing Enzymes for Use in Organic Solvents［J］. Biotechnol Prog, 1992, 8(4): 259-263

［11］ 吴冀华. 酶促茶油酯交换制类可可脂的研究：［硕士学位论文］. 郑州：郑州粮食学院, 1997

［12］ Shimada Y, Sugihara A, Maruyama K, et al. Production of Structured Lipid Containing Docosahexaenoic and Caprylic Acids Using Immobilized Rhizopus delemar Lipase［J］. J. Ferment. Bioeng., 1996, 81(4): 299-303

［13］ 徐凤彩. 酶工程［M］. 北京：中国农业出版社. 2001，174-184

［14］ Sakurai C, Margolin A L, Russell A J, et al. Control of Enzyme Enantio- selectivity by the Reaction Medium［J］. J Am Chem Soc, 1988, 110: 7236-7240［15］ 周国伟, 李干佐, 李越中等. 微乳液和微乳液凝胶中脂肪酶催化的酯合成反应［J］.化学学报, 2001, 59(3): 344-349［16］ Xu X, Mu H, Skands A R H, et al. Parameters Affecting Diacylglycerol Formation During the Production of Specific-Structured Lipids by Lipase-Catalyzed Interesterification［J］. J. Am. Oil Chem. Soc., 1999, 76(2): 175-181

［17］ Shishikura A, Fujimoto K, Suzuki T, et al. Improved Lipase-Catalyzed Incorporation of Long-Chain Fatty Acids into Medium-Chain Triglycerides Assisted by Supercritical Carbon Dioxide Extraction［J］. J. Am. Oil Chem. Soc., 1994, 71(9): 961-967

［18］ Rubingh D N. Protein Engineering from a Bioindustrial Point of View［J］. Curr Opin Biotech, 1997,8: 417-422

［19］ You L, Arnold F H. Directed Evolution of subtillisin E in Bacillus subtilis to Enhance Total Activity in Aqueous Dimethylformamide［J］. Protein Eng, 1996, 9: 77-83

［20］ 张红缨，孔祥铎，张令. 蛋白质工程的新策略——酶的体外定向进化［J］. 科学通报，1999，44(11)

［21］ Reetz M T. Evolution in the Test Tube as a Means to Create Enantioselective Enzymes for Use in Organic Synthesis［J］. Sci Prog, 2000, 83(2): 157-172［22］ Russell A J, Klibanov A M. Inhibitor-induced Enzyme Activation in Organic Solvents［J］. J Biol Chem, 1988, 263: 11624-11626

［23］ Dabulis K, Klibanov A M. Molecular Imprinting of Protein and Other Macro- molecules Resulting in New Adsorbents［J］. Biotechnol Bioeng, 1992, 39: 176-183

［24］ Okahata Y, Hatano A, Ijiro K. Enhancing Enantioselectivity of a lipid-coated Lipase via Imprinting Methods for Esterification in Organic Slovents［J］. tetrahedron: Asymmetry, 1995, 6: 1311-1322

［25］ Lalonde J J, Govardhan C, Khalaf N, et al. Crosslonked Crystals of Candida rugosa Lipase: Highly Efficient Catalysts for the Resolution of Chiral Esters［J］. J Am Chem Soc, 1995,117:6845-6852

?【作者介绍】 刘书来，(1977～)，郑州工程学院硕士，主要从事酶催化方向的研究。联系电话：0371-7942091。