冠状耳霉（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓｃｏｒｏ ｎａｔｕｓ）属接合菌亚门虫霉目,是一种常见的昆虫病原真菌,可侵染同翅目、鳞翅目、缨翅目、双翅目、鞘翅目昆虫以及蛛形纲的某些成员。该菌在侵染昆虫完成体壁穿透的过程中常分泌多种酶系,主要有蛋白酶、几丁质酶、脂酶、Ｄｎａｓｅ等。这些胞外酶系对侵入昆虫血腔、降解组织、破坏昆虫免疫系统起着重要的作用,其中对昆虫体壁降解最重要的酶系是胞外蛋白酶。冠状耳霉分泌的胞外蛋白酶均属碱性蛋白酶,该酶在ｐＨ值呈碱性的条件下具有最大酶活力,主要是在入侵昆虫坚硬的体壁过程中起水解蛋白质肽键的作用。目前,国内外对冠状耳霉所分泌碱性蛋白酶给予了高度的关注,由于具有重要的经济价值和产业化前景,已成为近几年来逐渐形成的研究热点之一。
酶的性质
碱性蛋白酶最早发现于猪胰脏中,１９１３年Ｒｏｈｍ首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。１９４５年瑞士学者Ｊａａｇ等发现微生物能产生碱性蛋白酶,如芽孢杆菌属细菌和曲霉属的真菌等,从而使蛋白酶应用拓展到洗涤剂工业。近２０年来,随着新的产碱性蛋白酶菌株的不断分离和发现,碱性蛋白酶的研究有了很大的发展。迄今,已有多种微生物来源的碱性蛋白酶被纯化和鉴定。
昆虫病原菌产蛋白水解酶的报道很少。自６０年代始,有关耳霉属菌株分泌碱性蛋白酶的报道日渐增多,研究日益深入。研究表明,耳霉能产生高分子量的碱性蛋白酶Ａ和低分子量的碱性蛋白酶Ｂ。冠状耳霉分泌的碱性蛋白酶Ｂ分子量蛋白为６８００,是迄今为止报道的分子量最小的碱性蛋白酶。它的最适ｐＨ９．７,最适反应温度４５℃。该酶经５０℃时１小时后完全失活。该酶具有广泛的底物专一性,能催化水解多种天然蛋白质(如酪蛋白,血红蛋白,卵清蛋白,牛血清白蛋白),其中酪蛋白是最适底物。此外,碱性蛋白酶Ｂ还具有一定的酯酶活性,可专一性水解苯赖氨酸和苯甘氨酸衍生物Ｌ-型异构体酯键的羧基,而Ｄ-型异构体不受酶处理的影响。可用于分离氨基的消旋混合物。可望代替目前工业上用来分离ＤＬ-旋光异构体的枯草芽孢杆菌蛋白酶。与其它产碱性蛋白酶菌株相比,冠状耳霉能分泌高比活力碱性蛋白酶。如地衣芽孢杆菌株２７０９碱性蛋白酶比活力为１８００ｕ／ｍｇ蛋白,枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶比活力为８８０ｕ／ｍｇ蛋白,短小芽孢杆菌碱性蛋白酶比活力为３６０２．４ｕ／ｍｇ蛋白,嗜麦芽假单胞菌碱性蛋白酶比活力为１１７３ｕ／ｍｇ蛋白。按相同活力单位比较,冠状耳霉碱性蛋白酶比活力约是我国最高碱性蛋白酶比活力的１５００倍。虽然结果是惊人的,但这毕竟是已被证实的事实。
酶的生产
冠状耳霉碱性蛋白酶大规模生产资料较少。为了获得既高又具商业价值的酶产量,一要获得优良的冠状耳霉产酶菌株,二要优化生长和产酶培养基,三要研究该菌的发酵条件。对生长和产酶培养的研究表明,蔗糖为最佳碳源,硝酸铵为最佳氮源,酪蛋白为最佳诱导剂,但未发现表面活性剂（ＳＤＳ,Ｔｗｅｅｎ２０,８０）对产酶有益,也未发现培养需要任何特殊金属离子。在ｐＨ７．０-７．５,接种量为１２%（ｖ／ｖ）,培养温度为２８℃下起始发酵,酶活在４８小时可达最高。
目前对摇瓶和实验室发酵罐中该菌发酵条件的研究已获得许多参数。摇瓶发酵研究表明,冠状耳霉生长和产酶的合适碳源是葡萄糖和蔗糖,甘油能增强菌体生长和产酶,冠状耳霉需要由大分子量蛋白质片段组成的复合氮源刺激产酶,而无机氮源和氨基酸氮源都将导致低生长和较低酶活。同时,冠状耳霉产酶高峰滞后生物量高峰１６小时。实验室规模发酵罐的发酵条件研究表明,升高通气率和搅拌速率均不同程度地减少酶产量。冠状耳霉的培养较其它常规菌种简单,如地衣芽孢杆菌常以玉米粉、豆饼粉作为碳源和氮源,而该菌也可用廉价的发酵料进行生产。同时产酶迅速,一般在４８小时左右达到产酶高峰。其它菌种如地衣芽孢杆菌在起始ｐＨ为７．０,通气培养４２-４８小时之间酶活力达到最高值,而米根霉在培养６天后才出现产酶高峰。由于冠状耳霉培养液经过滤易得到无微生物的酶溶液,与细菌生产碱性蛋白酶相比,过滤费用较为低廉。相比之下,冠状耳霉生产碱性蛋白酶的工艺过程易于放大到工业规模。
酶的应用与展望
碱性蛋白酶作为工业用酶被广泛地应用于食品,制革,洗涤剂等工业。目前在应用上主要是解决该酶的热稳定性和相容性问题,以利于提高该酶作为添加剂的效力,扩大其应用范围。国外有学者针对冠状耳霉碱性蛋白酶只在４０℃以下稳定的缺点,研究了提高该酶热稳定性的方法。研究表明,２５ｍＭ氯化钙能使酶在５０℃时的半衰期由１７分钟提高到４７分钟,１Ｍ的甘氨酸使酶在５０℃的半衰期从１７分钟提高到４２分钟,钙离子和甘氨酸的联合作用能使酶在５０℃时一小时之后残留酶活为４３%。冠状耳霉碱性蛋白酶与商业洗涤剂的相容性随品牌不同而异。虽然,目前洗涤剂行业上应用的细菌蛋白酶有较好的热稳定性,如来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｍｏｐｈｉｌｕｓ）的碱性蛋白酶在７０℃稳定２４小时,在钙离子保护下,８５℃的半衰期达４小时。但是,在发展中国家,洗涤剂通常在室温２８℃下使用,因此４０℃以下稳定的冠状耳霉碱性蛋白酶仍有希望应用于洗涤剂行业。
昆虫病原真菌冠状耳霉碱性蛋白酶ｐＨ稳定性,热稳定性,底物专一性以及与商业洗涤剂相容性的研究结果显示它具有应用于洗涤剂及其它行业的潜力。国外已注意到昆虫病原真菌冠状耳霉分泌的碱性蛋白酶的应用潜力。国内有学者也首次进行了冠状耳霉自然菌株产酶特性的研究。研究表明,冠状耳霉所产生的碱性蛋白酶水解蛋白质的能力极强,但分泌量极低。若能提高发酵单位,设计合适的提纯工艺,该酶的应用前景将十分光明。有关工作正在进行当中。对冠状耳霉分泌碱性蛋白酶的研究,不仅有利于丰富我国碱性蛋白酶及其生产菌种的种类,而且为开发昆虫病原真菌的丰富资源积累经验。
