微生物的生长代谢过程受碳源、氮源、生长因子和无机盐等多种培养基组分的影响， 要找出主要影响因子并对其浓度进行优化涉及多因素多水平实验。常用的正交设计或均匀设计虽在一定程度上可以解决上述问题， 但其要求实验次数多， 且无法反映因子之间的交互作用。响应面分析能够弥补上述统计方法的缺陷， 该技术包括实验设计、建模、因子效应评估以及寻找因子最佳操作条件［１］。本研究以菌株Ｆ－ １的发酵培养基为对象， 应用响应面分析方法考察培养基各组分对其降解胆固醇能力的影响， 并对主要影响因子的使用浓度进行了优化。
１ 试验材料和方法
１.１ 实验材料
菌株Ｆ－ １： 由实验室从土壤中筛选保藏；
斜面保藏培养基、发酵和种子培养基配方： 参考文献［２］。
１.２ 胆固醇降解酶酶活力的测定
采用邻苯二甲醛比色法， 以培养基中胆固醇的减少表示降解酶的活力， 见参考文献［３］。
１.３ 试验设计
部分因子实验设计： 采用２ 6-2部分重复因子设计［４－６］。
中心组合设计： 参照文献［３］进行。用最常用的统计软件ＳＡＳ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６.１２对实验数据进行回归分析，用检验测试回归系数的显著性， 用微分计算预测最佳点［４－６］。
２ 结果与讨论
２.１ 培养基成分对酶活力大小的影响
将浓度为１０12ｃｆｕ／ｍＬ的种子发酵液以１０％的接种量接入各组培养基中， ３０℃培养１５ｈ， 测定胆固醇降解酶活力。为了进行方差分析， 在２ 6-2部分重复设计的因子中心点处增加４次重复， 其设计及结果见表１， 培养基各组分对酶活力影响的显著性检验结果见表２和表３。
由表２可知， 吐温和酵母膏分别在９９％和９５％的概率水平上显著是影响酶活力大小主要的影响因素，而ＮＨ４ＮＯ３、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ和胆固醇在９０％的概率水平上对酶活力影响不显著。
由表３可知， Ｓｒ＝２.００４， Ｓｅ ＝０ . ８８９ ， 其自由度分别为１３、６。在ＳＡＳ软件Ｐｒｏｂ＞Ｆ项， 当ｐｒｏｂ＜０.０１时，称回归方程高度显著， 本试验中， 服从自由度为（１３，６）的Ｆ分布随机变量大于１０.３９５３的概率为０.００４４＜０.０１， 它等价于１０.３９５３， 大于Ｆ０.０１（１３，６）＝４.６２， 所以回归是高度显著的。
２.２ 最陡爬坡路径的确定
根据上述实验结果的回归分析， 可得一次拟合回 归 方 程 Ｙ ＝１.１４１４ ＋０.０２５６X1 － ０.０９９５X2 ＋０.０４０X3 ＋０.３３２３X4－ ０.００７４X5＋０.０２３４X6， 由回归方程可以看出减少吐温的用量， 增加酵母膏的用量对酶活力的提高有积极的意义。因此采用吐温每次减少０.０５ｍＬ， 酵母膏每次增加０.１５ｇ的方法， 考察两种组分的不同使用浓度对酶活力的影响， 结果见表４。由表４可知， 吐温和酵母膏浓度分别为０.９５ｍＬ／Ｌ和５.７５ｇ／Ｌ时， 酶活力达到最大值１.７４４×１０－３Ｕ／ｍＬ。
２.３ 培养基的优化
从上述最陡爬坡实验可以看出， 响应值Ｙ接近最大响应面区域。酶活力变化可以用中心组合设计对两个独立的过程即吐温和酵母膏的用量进行优化，试验设计和实验结果见表５， 显著性检验见表６。
用多项式回归技术对试验数据拟合得二次多项式方程：Ｙ＝１.９１２４＋０.１３５３３Ｘ1－ ０.０６４５７１Ｘ2－ ０.０９４２Ｘ1－２０.０７１２５Ｘ１Ｘ2－ ０.１７４９５Ｘ2 ， 该方程ｂ１１、ｂ２２均为负值， 抛物线的开口向下， 因而有极大值点； 方差分析中Ｆ回归＝ＭＳＲ／ＭＳｃ＝１９.３８８８６＞Ｆ５，７，０.０１＝７.４６， 表明模型在０.０１水平上回归显著， 经计算该模型的确定系数Ｒ２＝０.９３２７，表明模型能解释９３％酶活力的变化。可见该方程是培养基主要组分与酶活力关系的合适数学模型。图１绘出了计算的三维响应面， 证实了拟合面有真实的最大值。
对上述方程进行求导得出模型的极值点， 即吐温为０.９０５ｍＬ、酵母膏为５.６９４ｇ时， 酶活力为１.９８２×１０－３Ｕ／ｍＬ。摇瓶实验测得的数据（１.８７６×１０－３Ｕ／ｍＬ）证实了模型预测值与实验值之间的良好拟和性， 也证实了模型的有效性。
３ 结论
实验证明响应面方法对培养基优化是非常有效的工具， 部分重复因子实验能对各因子的效应进行评价并能有效地找出主效因子， 最陡爬坡法能充分接近最大响应面区域， 中心组合设计能快速地对主要影响因素进行优化， 找出最佳值。本研究经响应面方法优化， 得出菌株Ｆ－ １产胆固醇降解酶的最佳培养 基 配 方 为 ： ＮＨ４ＮＯ３ １.０ｇ／Ｌ， ＫＨ２ＰＯ４ ０.２５ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０.２５ｇ／Ｌ， ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １ｍｇ／Ｌ， 酵 母 膏５.６９４ｇ／Ｌ； Ｔｗｅｅｎ－ ８０ ０.９０５ｍＬ， 胆固醇１.０ｇ／Ｌ。
参考文献：略
