【摘 要】 本文综述了溶菌酶的结构特点与作用机理，从生产工艺的角度介绍了当今蛋清溶菌酶提取的工艺过程中，不同的生物化学方法及其操作特点，以及溶菌酶活性与纯度测定的方法。
【关键词】 溶菌酶；蛋清；生物化学；酶活力测定
溶菌酶又称脆壁质酶或N一乙酰壁质聚糖水解酶，是英国细菌学家弗莱明于1922年在鼻粘液中发现的强力杀菌物质，溶菌酶的发现是近代酶化学 研究的最大成果之一[1]。自然界中，鸟类和家禽的蛋清溶菌酶含量最多，鸡蛋清约含0.3％[2]。
溶菌酶的用途很多，食品工业中由于溶菌酶本身是一种天然蛋白质，无毒性，是一种安全性高的食品添加剂，可以作为防腐、保鲜剂，广泛应用于乳制品、低度酒、饮料、水产品、肉类制品和糕点等的防腐保鲜；在医药上，溶菌酶具有多种药理作用，广泛应用于临床医学，溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效；在生物技术中，溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取[1，3] 。
1 溶菌酶的结构特点与作用机理
溶菌酶又称胞壁质酶或N一乙酰胞壁质聚糖水解酶，全称为1,4-β-N-溶菌酶，是一种葡萄糖苷酶。鸡蛋清溶菌酶是研究最清楚的一种溶菌酶，其化学性质稳定，干燥条件下在室温可长期保存，其纯品为白色或微黄色结晶体或无定型粉末，无嗅，味甜，易溶于水，不溶于丙酮、乙醚，分子量l4000～l5000Da,等电点为pH 11左右，最适效应温度在50℃；它由18种129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，在分子中的4对含硫氨基酸Cys间形成4个S-S键。Phillips等人1965年用x射线晶体结构分析法阐明了溶菌酶的三维结构，溶菌酶分子近椭圆形， 大小为4.5nm3.Onm3.Onm，其构象复杂，α螺旋仅占25％，在分子的一些区域有伸展着的β片层结构，研究表明溶菌酶的内部几乎都为非极性的，疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起到重要作用，其分子表面有一个容纳多糖底物6个单糖的裂隙，此裂隙为溶菌酶的活性部位[2，4]。
溶菌酶的生物化学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁，细胞壁多糖是N-乙酰氨基葡糖(NAG)和N-乙酰氨基葡糖乳酸(NAM)的共聚物，NAG及NAM通过1,3-1,4糖苷键而交替排列。Salton等人于1959～1963年通过大量研究证明，溶菌酶能够切断N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间1,3-1,4糖苷键，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压作用下细胞胀裂开，引起细胞裂解。而后Phillips等人[5]根据研究提出了溶菌酶的催化作用机制，提出了晶体学说并通过各种化学实验得到验证。实验发现，由于G+细菌没有由脂多糖、磷脂、糖脂组成的外膜覆盖，所以溶菌酶对它们作用较强。这是溶菌酶应用的基础，也是它得名的原因。
2 溶菌酶提取方法
目前溶菌酶可以以鸡蛋清和蛋壳膜为材料提取制得，常用的方法有亲和层析法、离子交换柱法、直接结晶法和聚丙烯酸沉淀法等。
2.1 亲和层析法
亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一性亲和力而设计的色谱技术。酶-底物复合物形成之后，在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。常常使用的吸附剂为几丁质及其衍生物，如：几丁质粉、羧甲基几丁质、几丁质包埋纤维素、脱氨几丁质粉、N-酰化壳聚糖、脱氨再生几丁质凝胶[6]。
王炜军[7]等人探讨了磁性亲和分离方法，磁性介质已被广泛用于分离细胞及核酸、蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物活性物质。其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其他固形物杂质间的分离，尤其是当待分离的液体样品含有固形物或较为粘稠时更显现其优越性。蛋壳上残留有大量的蛋清，是制备溶菌酶的潜在资源，但蛋壳清洗液中常混有泥沙、蛋壳和蛋壳膜碎片等杂质，且粘度较大，用一般的亲和层析时易造成层析柱的堵塞．在原有亲和凝胶介质的基础上进一步制备了具磁性的几丁质凝胶亲和介质，即在原有亲和层析介质的基础上引入具磁响应性的Fe3O4颗粒，使得介质复合了特异亲和吸附和磁响应性的功能，但使用这种方法时，随着Fe3O4颗粒的引入同时又导致了介质对杂蛋白的非特异吸附。为克服这种非特异吸附，采用了内含0.5 mol/L NH4Ac的磷酸缓冲液进行充分洗涤，取得了较好的效果，但这种吸附最终也导致了部分活力回收的丧失。
2.2 离子交换树脂法
离子交换法是利用离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应来进行分离的，分离的效果较好，广泛用于微量组分的富集。一般流程为：鲜蛋一预处理一搅拌吸附一上柱洗脱一等电点沉淀一透析一喷雾干燥一成品。
将蛋壳清洗冲去杂物，于4℃条件下冷藏放置过夜，粉碎成末，用1.0％NaCl溶液(pH3.0)抽提，分3次在40℃条件下抽提并去滤渣，水浴搅拌保温1h，趁热过滤，合并3次抽提液即为酶抽提液，抽提液pH 自然上升到6.0。蛋壳可作进一步综合利用。溶菌酶分离纯化，将酶抽提液调至pH-4．6(卵粘蛋白等电点，于沸水浴迅速升温至75℃ ，维持5min，流水冷却至室温，用20％NaOH 调pH至9.5(使Ca2+形成沉淀)，静置5-6h，过滤或离心除去沉淀，再将pH调至中性。724树脂经浸泡处理去杂质，以2mol/L NaOH转型为Na+ 型阳离子树脂，1/15（mol/L）磷酸缓冲液（pH6.46）平衡过夜。动态交换法洗脱，先将处理转型后的树脂装柱，酶抽提液以1.6mL/min流速缓慢通过（2g蛋壳粉/mL树脂）处理好的724树脂柱，再用3倍体积1/15（mol/L）磷酸缓冲液(pH6.46)洗涤树脂柱，除去未吸附杂质(蛋白)，以10％(NH4)2SO4 溶液洗脱，洗脱液经核酸蛋白检测仪(λ=280nm)检测，部分收集器收集含溶菌酶的洗脱液。树脂则进行充分清洗转型后备用。含酶洗脱液经截留分子量(MWCO)为5000Da 的聚砜膜超滤浓缩脱盐，冷冻干燥得成品。亦可加终浓度至5％的NaCl,4℃ 静置24h得结晶。
2.3 食盐直接结晶法
溶菌酶是一种盐溶性蛋白质，而蛋清中其他蛋白质的等电点都为酸性条件。利用这一特点，在蛋清中加入一定量的氯化物、碘化物或碳酸盐等盐类，并调pH值至9.5-10.0，降低温度，溶菌酶会以结晶形式慢慢析出，而大多数蛋白质仍然存留在溶液中。
在超滤浓缩脱盐后，为获得较纯产品,采用结晶纯化步骤, 酶液经超滤处理后, 用NaOH调整pH 9.5, 离心去除氢氧化钙, 上清液在缓缓搅拌下, 加NaCl至5% , 静置一周, 得粗结晶。粗结晶溶于pH 4.6醋酸水中, 分去不溶物后, 进行重结晶, 二次结晶的最终得率为60% 左右。即每公斤蛋壳中可得重结晶产品近1.3g, 活力测定为8000U/mg。
2.4 聚丙烯酸沉淀法
聚丙烯酸沉淀法为将提取过滤后含酶洗脱液，首先经过吸附步骤，即将过滤后的澄清溶液用20％的NaOH溶液调pH至6.0，在调pH值的过程中不停的搅拌。有少量的乳白色沉淀析出，然后加入15％聚丙烯酸，立即有白色沉淀析出，加至pH值为3.0为止，静置17个小时进行倾析，得到粘附于底部的乳白色胶状物。第二步解离,将前步得到的溶菌酶聚丙烯酸凝聚物。加入少量蒸馏水并用0.5 mol/L 的Na2CO3，将其溶解，转移后，将pH值调到9.5。加入5％CaCl2溶液将溶菌酶聚丙烯酸解离，至无沉淀析出，然后过滤，得到澄清溶液。第三步盐析，将所得澄清溶液加入5％的NaCl溶液搅拌均匀．放入冰箱调温度为0℃。待有晶体析出后，用无水乙醇洗涤数次，置恒温培养箱中40℃条件下干燥称重。
2.5 超滤法
超滤是一种以压力为动力，利用超滤膜不同孔径对液体进行分离的物理筛分过程。蛋清溶菌酶是小分子物质，并且与蛋清中其他相对分子质量高的蛋白质存在着静电作用力，以结合态存在，采用不同的前处理工艺，降低溶菌酶与其他蛋清蛋白之间的作用力，使溶菌酶处于解离状态后，采用超滤的方法对蛋清溶菌酶进行分离提取。
张灏等人[8]通过试验初步确立了蛋清溶菌酶的超滤工艺：即料液的pH值8.5，采用截留相对分子质量为3万的PES膜，连续方式稀释3倍进行超滤；透过液用截留相对分子质量为3000的PES膜进行浓缩，冷冻干燥后得到蛋清溶菌酶样品，酶活力为每毫克蛋白质14610 U或16831 U，经电泳检测酶的纯度较高。
3 溶菌酶测定
3.1 溶菌酶活力测定
3.1.1 琼脂板扩散法
琼脂板扩散法是借鉴抗生素的纸片琼脂平板扩散法测定生物效价的原理，建立的简便易行的溶菌酶活力测定方法，即把酶样定量滴在一定规格的圆形小纸片上，置于混有试验菌的琼脂平板上，样品在平板上以浓度为推动力的扩散产生相应大小的抑菌圈，通过测量抑菌圈的直径可以定量溶菌酶活力。
3.1.2 比浊法
比浊法采用溶菌小球菌为底物，苍金荣等[9]采用聚苯乙烯微量反应板，建立了微量快速比浊检测溶菌酶的方法，具有线性关系好，标本用量少，反应时间短，准确，灵敏度高的特点。
3.1.3 比色法
比色测定法是将微球菌加等量艳红染料，同时加入一定量的1．25mol／L NaOH，搅拌一定时间，让染料渗入到细胞壁内，然后洗除多余的染料，裂解的程度(颜色的深浅)与溶菌酶的含量成正比。
3.1.4 琼脂糖火箭电泳法
采用琼脂糖火箭电泳法测定唾液溶菌酶活性，将酶学方法和电泳技术结合，使溶菌酶在电场中泳动，在通过含有作用底物的凝胶时与溶壁微球菌发生水解作用，形成透明的溶菌峰，根据峰值与溶菌酶浓度的对数成正比的关系，求得样品溶菌酶含量。
3.1.5 紫外分光光度法
用1cm 比色皿，以0.85％的氯化钠溶液为参比溶液，于λmax=281 nm处依次测定各标准溶液的吸光度并绘制标准曲线。准确称取新鲜鸡蛋的蛋清样品0.5921g，溶解于0.85％的氯化钠溶液中并定容至1O0.0 ml 。按照标准曲线的操作步骤，在λmax=281 nm 处测量此样品溶液的吸光度。平行测定5次取结果的平均值，由标准曲线上确定此吸光度对应的溶菌酶的含量。
3.2 溶菌酶纯度检验
可采用CM52羧甲基纤维素色谱柱分别对上样液、洗脱液及标准溶菌酶进行分析。
林亲录、马美湖[6]等将冻干的溶菌酶分别溶在0.1mol／L pH6.2的磷酸缓冲液中，溶菌酶的浓度为50µg/ml，取25µl点样于聚丙烯酰胺凝胶(SDS—PAGE)板上，64mA电泳4h。经考马斯亮蓝显色后再显微拍照。还可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定溶菌酶纯度，并用凝胶成像系统软件进行数据的采集和分析[10]。
4 展望
在环境污染日趋严重的当今世界，在倡导绿色食品的今天，溶菌酶作为一种天然蛋白质，能在胃肠内作为营养物质被消化和吸收，对人体无毒性，也不会在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。我国虽然是产蛋大国，但蛋的深加工层次低，研究发展溶菌酶的生产，对于提高蛋品的附加值，推动国民经济的发展，是一项具有十分重要意义的工作。
参考文献
[1] 戴清源.溶菌酶的研究进展[J].山东食品发酵,2005(3):23-25.
[2] 林翠花.溶菌酶结构特点及其应用[J].潍坊学院学报,2005, 2(5):108-110.
[3] 刘仲敏,何伯安.溶茵酶及其在食品工业中应用[J].食品与发酵工业,1995(5):80-82.
[4] Alexander J,et a1.Exon encode functional and structural units ofchicken lysceyme[J].Pme Natl Acad Sci USA,1980,77(10):5759．
[5] Ford LD,et a1.Crystal streucture of a lysozyme-tetrasaccharide lac-tone complex[J].J Mol Biol,1974,8:349．
[6] 林亲录,马美湖.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J].食品科学,2002,2(23):43-46.
[7] 王炜军,方 颖,黄国林.蛋壳残留溶菌酶的磁性亲和分离[J].华南农业大学学报,2005,4(26):62-66.
[8] 张灏,赵玉萍,杨严俊.超滤法提取蛋清溶菌酶[J]. 无锡轻工大学学报,2002, 6(21):607-612.
[9] 刘源岗,邓倩莹,廖问陶.溶菌酶的活性测定[J].食品科技,2005,(10):71-73.
[10] 郭勇.酶的生产与利用[M].北京:化学工业出版社,2003.
【作者简介】张航航（1982-），男，山东龙口人，助理讲师，研究方向为化学。
