海因酶 (Hydantoinase EC 3.5.2.2 )又称二氢嘧啶酶 (dihydropyrimidinase) ,能不对称水解 DL-对羟基苯海因 (P- hydroxyphenylhydantoin,P-HPH) ,使其转变为 D- N -氨基甲酰对羟基苯甘氨酸(N- Carbamoyl- D- P- hydroxyphenylglycine,即 C-D- P- HPG) ,再经酸性条件下用 Na NO2 水解得终产物 D-对羟基苯甘氨酸 (D- P- hydroxyphenylglycine,D- P- HPG) <1>。D- P- HPG可以作为 β-内酰胺类抗生素、诺卡菌素、万古霉素等抗生素和某些激素等多种药物的侧链组成部分 ,其中 β-内酰胺类抗生素抗菌能力强 ,抗菌谱广 ,人们又不断研究新一代系列 ,因此作为原料药的 D- P- HPG的生产 ,将会有广阔的市场前景。生物酶转化生产 D- P- HPG,具有专一性强、反应条件温和、副反应和三废少、转化率高等优点 <2 > ,因而是目前国际上普遍选用的生产方法 ,建立半合成抗生素一些重要侧链 (包括 D- P- HPG)的酶转化生产方法是我国“九五”生物高科技发展计划的组成部分。我们拟研制 D- P- HPG,为此 ,我们首先从九株细菌中选出海因酶活力相对较高的一株腐臭假单胞菌 950 5(Pseudomonasputida 950 5) ,然后又研究了能促进底物 (P- HPH)溶解 ,从而提高酶促反应转化率的有机溶剂。
1 材料与方法
1.1 材料
1. 1. 1 菌种
腐臭假单胞菌 (Pseudomonasputida) 950 1、950 2、950 3、950 4、950 5及 950 6 ,茄科假单胞菌 (Pseudomonassolanacearum) ,根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) ,微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)。以上菌种购自美国USDA。
1.1.2 培养基、试剂
肉汤培养基 (牛肉膏 0.5% ,Na Cl 0.5% ,胨 1 % ) ;斜面培养基 (牛肉膏 0.5% ;Na Cl0.5% ,胨 1 % ,琼脂 1.2 % ) ,发酵培养基 (牛肉膏 1 % ,酵母膏 1 % ,葡萄糖 0.5% ,Na Cl 0.3 % ,Uracil 0. 1 % ) ;对羟基苯海因 ;聚乙二醇 2 0 0(PEG2 0 0 ) ,对 -二甲氨基苯甲醛 (PDAB) ;吐温 - 80 ;二甲亚砜 (DMSO) ;N,N-二甲基甲酰胺 (DMF。以上培养基的 p H均为 7.0～ 7.2。
1.2 方法
1.2.1 酶的比活力的测定
测定原理是利用酶转化产物 C- D- P- HPG与显色剂 PDAB反应显黄色 <3 > ,在 43 8nm的吸光值的大小与 C- D- P- HPG的量成正比。 1个酶活力单位定义为在测定条件下每分钟产生 1 μmol C- D- P- HPG所需的酶量。酶的比活力为 1 ml细菌发酵液所含多少个酶活力单位。
1.2.1.1 微孔快速筛选海因酶产生菌
将细菌从斜面接种划线于平板上 ,2 8℃培养 2 1小时。配制含P- HPH 0.9%的 Tris- HCL (p H 9.0 ) <4 ,5> ,加热使P- HPH完全溶解 ,制得底物液。每孔各加 1 0 0μl底物液 ,于 3 7℃保温 ,少许底物析出。将培养 2 1小时后的细菌 ,从平板上各挑少许加入各孔的底物液中 ,3 7℃放置 0. 5小时 ,然后在各孔中加入 1 0 %的PDAB(用 6 mol/L HCl配制 ) 1 0 μl,高酶活菌的反应液会立即呈现黄色。
1.2.1.2 海因酶的比活力的定量测定法
将菌种接种活化于 5ml肉汤培养基中 ,2 8℃培养 2 0.5小时 ,以 5%的接种量接入 1 0 ml的发酵培养基中 ,在2 8℃ ,1 70 r/min的旋转摇床上培养 1 3.5小时。将培养好的细菌发酵液充分振荡后 ,吸取 5ml,以3 50 0 r/min离心 3 0分钟 ,弃上清 ,吸 1.5ml生理盐水 ,充分洗涤沉淀 ,离心 1 5分钟 ,弃上清 ,加 1.5ml生理盐水于沉淀中混匀 ,制得菌悬液。吸取 0.5ml菌悬液 ,然后加入 0.9%的 P- HPH1.5ml(Tris-HCl,p H8.5) ,在 3 7℃ ,1 0 0 r/min的旋转摇床上振荡反应 3 0分钟 ,加 1 2 %三氯乙酸 0.5ml终止反应 ,加入 0.5ml PDAB,1 ml蒸馏水 ,以 3 50 0 r/min离心 3 0分钟 ,吸出上清液 ,于 43 8nm处测吸收度。
1.2.1.3 酶的比活力与 A43 8的关系
配制2 mmol/L的 C- D- HPG储备液 ,稀释至系列标准浓度的 C- D- HPG溶液与 PDAB反应。线性回归 ,A43 8=0.1 3 3 VC-D-P-HPG(ml) (r=0.9980 ) ,从而进一步计算得海因酶的比活力 (U/ml细菌发酵液 ) =0.3 4 4A4 3 8。见表 1。
表 1 C-D-P-HPG的标准曲线
Table1 The standard curve of C-D-P-HPG
12 3 4 5 6 7 89VC- D- P- HPG(ml)
0.0 0 0.2 5 0.3 5 0.45 0.5 5 0.6 5 0.75 0.85 0.95VH2 O(ml) 3.0 0 2.75 2.6 5 2.5 5 2.45 2.3 5 2.2 5 2.15 2.0 5VPDAB(ml) 0.5 0 0.5 0 0.5 0 0.5 0 0.5 0 0.5 0 0.5 0 0.5 0 0.5 0A43 80 0.0 2 40.0 40 0.0 6 0 0.0 6 5 0.0 85 0.10 0 0.110 0.12 01.2.2
有机溶剂对酶反应转化率的影响 在反应体系中加入以下各种有机溶剂 ,使其最终浓度为 :PEG2 0 0 (1 0 % ,2 0 % ,3 0 % ) ,DMSO(2 % ,5% ,1 0 % ) ,DMF(2 % ,5% ,1 0 % ) ,Tween- 80 (1 % ,2 % )。
2 结果
2.1 微孔快速筛选海因酶产生菌由表 2可见 ,Pseudomonas putida 950 5为产酶菌。虽然 Corynebacterium flavescens在反应液中显黄色 ,但其对照液也显黄色 ,故而推断 :该菌自身分泌的黄色物质是其反应液显黄色的原因。采用比活
表 2 海因酶产生菌的微孔快速筛选
Table 2 The millipore rapid screening of hydantoinase productionstrains
12 3 4 5 6 78910A ----+ + ----B -----+ ---- A:0.9% P-HPH solution;B:control solution;+ :yellow;-:colorless;1:Pseudomonas putida95 0 1;2 :Pseudomonas putida95 0 2 ;3 :Pseudomonas putida 95 0 3 ;4:Pseudomonas putida 95 0 4;5 :Pseudomonas putida 95 0 5 ;6 :Corynebacterium flavescens;7:Pseudomonas putida 95 0 6 ;8:Agrobacterium tumefaciens;9:Pseudomonas solanacearum;10 :None力的定量测定法复证 Pseudomonas putida 950 5的酶比活力为 0. 0 2 5U/ml 而 ,Corynebacteriumflavescens的酶比活力为 0 U/ml。
2.2 有机溶剂对酶反应转化率的影响
吐温 - 80 (1 % )能较好溶解底物 P- HPH,提高转化率 ,结果见表 3。
表 3 有机溶剂对酶比活力的影响
Table3 Effect of various solvents on enzyme activitySolvent (% ) Specific activity(A43 8)PEG 10 0.0 6 8PEG 2 0 0.0 3 0PEG 3 0 0.0 15DMSO 2 0.0 88DMSO 5 0.0 6 3DMSO 10 0.0 3 0DMF 2 0.0 84DMF 5 0.0 5 4DMF 10 0.0 19Tween-80 10.15 3Tween-80 2 0.13 6Control 0.0 75
3 讨论
本文报道的方法能够快速筛选高酶活菌 ,且能够避免某些细菌自身分泌黄色物质带来的干扰。曾经报道过的快速大量筛菌的方法主要有两种 :一是双层琼脂法 <6> ,二是以单一的海因类化合物或其类似物作唯一氮源来筛选产酶菌<7> 。但两种方法均存在一定的弊端 ,前者不能排除细菌自身产生黄色物质带来的干扰 ,且耗时依然较多 ;通过实验发现 ,后一种方法会漏筛掉一些高酶活菌 ,这可能是由于某些高产酶活菌需要酵母膏等氮源中的非氮微量成分 ,因此尽管它们的海因酶活力较高 ....
