Ｓ＿腺苷＿Ｌ＿蛋氨酸(Ｓ＿ａｄｅｎｏｓｙｌ＿Ｌ＿ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ,ＳＡＭｅ或ＳＡＭ)是一种广泛存在于活体细胞内的生物小分子,分子量为399。细胞内的ＳＡＭ是由ＡＴＰ:蛋氨酸腺苷转移酶(ＭＡＴ)催化等分子的Ｌ＿蛋氨酸和ＡＴＰ合成得到的[1]。ＳＡＭ是甲硫键型高能化合物,其合成是一个高能耗过程;ＡＴＰ既是ＳＡＭ合成的关键性前体之一,又为ＳＡＭ的合成提供必要能量,在ＳＡＭ合成中起着十分关键的作用[2]。ＳＡＭ对人体生理功能发挥着重要作用,作为基团的提供者和酶的诱导剂参与多种关键的生化反应,如脂类,核酸,蛋白质的甲基化,对保持细胞膜质的流动性以及肝脏内谷胱甘肽的水平具有重要的作用[3]。在临床中用于肝病[3,4]和抑郁症[3,5]的治疗,对关节炎、纤维性肌痛和偏头疼[3]也有很好的作用。因此具有十分广阔的市场前景。ＳＡＭ的生产制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促转化法三种。文献报道酵母细胞可以有效地积累ＳＡＭ,采用发酵法通过在培养基中加入前体Ｌ＿蛋氨酸来合成是目前工业规模生产ＳＡＭ的主要方法[6],但酵母的发酵水平不高,一般在1000～3000ｍg/L,在相对大量的Ｌ 蛋氨酸存在条件下,酵母细胞无论生长、不生长都可积累ＳＡＭ,如Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ,Ｃａｎｄｉｄａ,Ｈａｎｓｅｎｕｌａ等[7]。其中,酿酒酵母属微生物具有较高的过量积累ＳＡＭ的能力,是最常用的微生物。目前对ＳＡＭ的生产研究还处于初级阶段。Ｓｃｈｌｅｎｋ等[6]用从富含Ｌ 蛋氨酸的面包酵母中提取ＳＡＭ,取得了一定的进展,ＳＡＭ含量达到50ｇ ｇ(ＤＣＷ),但生物量很低,无法形成可行的生产工艺。Ｍａｒｔｈｅｗｓ等[8]则利用基因工程手段,将ＳＡＭ合成酶的基因片段克隆到Ｅ.ｃｏｌｉ(ｍｅｔＫ)中表达,从中提取酶用于ＳＡＭ的合成,尽管产物纯度高,但成本非常昂贵,不适合工业化生产。国内学者近年来也开展了有关ＳＡＭ的研究,与国外相比,国内的研究尚处于实验室水平上。刘慧等[9]利用啤酒厂废酵母联产ＳＡＭ和谷胱甘肽(ＧＳＨ),ＳＡＭ和ＧＳＨ含量分别达到45ｇ/ｇ(ＤＣＷ)和18ｇ/ｇ(ＤＣＷ),生物量为35g/L。王远山[10]等人从土壤中筛选的酵母菌株产量达到861ｍg/L。陈小龙等[11]对培养基和发酵条件进行优化,ＳＡＭ积累量达到1946ｍg/L。李东阳等人[12]在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ表达酿酒酵母ｓａｍ2基因,发酵7ｄ后产量为1.72g/L。但国内还尚无ＳＡＭ规模化生产的报道,对ＳＡＭ的研究仍是当前急需解决的问题。本文将高密度发酵平台技术成功应用于ＳＡＭ发酵,考察了补加前体Ｌ＿蛋氨酸的策略和补加量对ＳＡＭ积累的影响。通过在菌体高密度的条件下以速率为2g/h流加前体Ｌ＿蛋氨酸5ｈ,ＳＡＭ的积累量可达到4.98g/L。进一步证实了高密度发酵平台技术的通用性,并为ＳＡＭ工业化奠定了一定的基础。
1 材料和方法
1.1 菌株酿酒酵母ＳＡＭ＿04＿Ｇ14由本实验室保藏。
1.2 培养基
1.2.1 斜面培养基:麦芽汁10g/L、酵母粉3g/L、蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、琼脂20g/L。
1.2.2 种子培养基:葡萄糖30g/L、酵母粉6g/L、磷酸氢二铵3g/L、硫酸镁0 8g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L。
1.2.3 发酵培养基:葡萄糖50g/L、酵母粉15g/L、麦汁60g/L、磷酸氢二铵10g/L、硫酸镁5g/L、玉米浆16g/L、磷酸氢二钾1g/L、磷酸二氢钾1g/L、Ｚｎ2+10ｍg/L、Ｆｅ2+10ｍg/L、Ｃｕ2+6ｍg/L和Ｍｎ2+6ｍg/L。
1.3 分析方法
1.3.1 细胞干重(ＤｒｙＣｅｌｌＷｅｉｇｈｔ)ＤＣＷ的测量方法:取一定体积的发酵液经4000r/min离心10min后收集菌体,用去离子水洗2次后105℃下烘2ｈ后称重,计算出细胞的质量浓度。
1.3.2 葡萄糖浓度的测定:用酶膜法(生物传感分析仪ＳＢＡ＿40Ｃ,山东省农科院)。
1.3.3 ＳＡＭ含量的测定:发酵液离心(4000r/min)10min,收集菌体,蒸馏水洗后用1.5mol/L的高氯酸室温破碎1 5ｈ。离心(4000r/min)10min收集上清液,适当稀释后采用高效液相色谱法定量分析。ＨＰＬＣ条件:ＡｇｉｌｌｅｎｔＣ18柱(250ｎｍ×4 6ｍｍ);流动相:0.01mol/L的甲酸铵,用甲酸将ｐＨ值调至3.0;流速:1.0ｍL/min;检测波长:256ｎｍ;柱温:25℃;进样量:5μＬ。标准品(购自ＳＩＧＭＡ公司)峰面积与浓度关系作出标准曲线,样品在256ｎｍ的峰面积代入标准曲线换算得到ＳＡＭ的含量。
1.4 发酵罐培养全自动发酵罐5Ｌ(上海保兴)中装液量2Ｌ,接种量10%(体积分数),前2ｈ搅拌转速为200r/min,之后按每小时提高100r/min逐步提高到6ｈ的600r/min,以后一直维持在600r/min,通气量为2L/min,温度控制在30℃,ｐＨ值采用氨水控制在5左右,外接乙醇在线测定仪(华东理工大学,上海)。当底糖浓度低于1g/L时开始流加葡萄糖。底糖消耗完后,通过控制流加葡萄糖的速率,维持乙醇含量逐步下降,葡萄糖积累量不高于1g/L来达到高密度发酵[13]。实验结果由3次的平均值得到。
2 结果
2.1 不补加前体Ｌ＿蛋氨酸的发酵
不补加前体Ｌ＿蛋氨酸考察ＳＡＭ的积累,通过维持乙醇的低积累率[12]来达到高密度发酵。实验结果见图1。在没有前体Ｌ＿蛋氨酸的条件下,ＳＡＭ的积累量很低,最高为0.42g/L。生物量可以达到很高,发酵结束时为130.3g/L。
2.2 前体补加量对ＳＡＭ积累量的影响
在摇瓶培养24ｈ后,对于每10ｇ干重菌体的发酵液分别加入0.1～1.5ｇＬ＿蛋氨酸,转化24ｈ后测量ＳＡＭ积累量,见图2。从图2可以看到,不同补加量对ＳＡＭ积累的影响,在补加Ｌ＿蛋氨酸的量达到0.7ｇ-10ｇ菌体干重时,ＳＡＭ积累量基本不变。考虑到高密度发酵干重达到130g/L。所以补加Ｌ 蛋氨酸总量量不应低于9ｇ。
2.3 前体补加时间对生物量,ＳＡＭ积累量和ＳＡＭ含量的影响
摇瓶考察0～30ｈ内不同时间补加前体Ｌ＿蛋氨酸(0.7ｇ/10ｇ菌体干重)对ＳＡＭ积累量的影响。结果见图3。由图3可以得到:生物量随着补加时间的后移而明显增加,这是由于Ｌ＿蛋氨酸影响细胞生长和增殖所造成的。而ＳＡＭ积累量随着补加时间的后移先呈明显增加趋势,在25ｈ时补加Ｌ＿蛋氨酸ＳＡＭ积累量达到最高,25ｈ后有明显的下降趋势,原因可能是ＳＡＭ合成酶总量随细胞数量增加而增加,而后期酶活下降。ＳＡＭ含量随补加时间后移呈下降趋势。由图3的信息,提出下面5种在发酵罐上的补加策略:
(1)在培养基中加入Ｌ＿蛋氨酸;
(2)在发酵前期(底糖耗尽后)流加Ｌ＿蛋氨酸;
(3)在菌体达到高密度时一次性补加(0.7ｇ/10ｇ干菌体);
(4)在菌体密度达到比较高水平(60g/L)时进行流加;
(5)在高密度菌体条件下进行流加。
2.4 在培养基中加入Ｌ＿蛋氨酸
在培养基中加入5ｇＬ＿蛋氨酸。至50ｈ发酵结束。图4表示了培养基中加入Ｌ＿蛋氨酸后的实验结果。由图4可以看到ＳＡＭ的积累量是逐渐升高又缓慢下降的,原因可能是生物量的增加与ＳＡＭ的积累都是耗能过程,所以当菌体生长能量不足时会分解ＳＡＭ而释放其中的能量。最高产量达到1.51g/L,此时生物量为58g/L。生物量仅有不补加Ｌ＿蛋氨酸实验的44.6%,可见蛋氨酸对于菌体生长有很大的抑止作用。
2.5 在发酵初期(底糖耗尽时)流加Ｌ＿蛋氨酸
由图3可以看到,发酵初期补加Ｌ＿蛋氨酸,ＳＡＭ含量较后期高40%左右。考虑到Ｌ＿蛋氨酸对菌体生长的抑止,选择发酵初期流加低浓度的Ｌ＿蛋氨酸。在底糖低于1g/L时,以0 1g/h流加Ｌ＿蛋氨酸至发酵结束,实验结果见图5所示。从图5看到,发酵36ｈ后,ＳＡＭ最高产量达到1.97g/L,此时生物量为57.7g/L,与图1相比,生长滞后12ｈ。最终生物量比不补加Ｌ＿蛋氨酸的实验低38 1%。ＳＡＭ积累量达到最高后也有比较明显的分解趋势。
2.6 在菌体达到高密度时一次性补加前体Ｌ＿蛋氨酸在菌体密度达到120g/L时,按每10ｇ菌体补加0.7ｇＬ＿蛋氨酸计,一次性补加9ｇＬ＿蛋氨酸。实验在补加前体Ｌ＿蛋氨酸前,ＳＡＭ积累量增长很缓慢,当生物量达到120ｇ干菌体时,ＳＡＭ积累量仅有0.4g/L。加入前体Ｌ＿蛋氨酸后ＳＡＭ积累量迅速增长,补加Ｌ＿蛋氨酸18ｈ后,ＳＡＭ积累量达到最高点4.31g/L,生物量最终达到130g/L。达到最高点后有明显下降的趋势,原因可能是菌体达到生长极限,ＳＡＭ合成酶数量不再增加,而ＳＡＭ转甲基酶开始起主导作用[3,14]。
2.7 在菌体密度达到比较高水平(60g/L)时进行流加菌体密度达到60g/L时流加Ｌ＿蛋氨酸,速率为0.7g/h。流加直至发酵结束,维持过量的Ｌ＿蛋氨酸以防止ＳＡＭ的分解。发酵结果如图7所示。流加,ＳＡＭ最高积累量达到2.13g/L,生物量达到83g/L。可以看到,当Ｌ 蛋氨酸流加后的30ｈ到60ｈ,ＳＡＭ积累量很快提升至2.13g/L,生物量增长很缓慢,从62g/L提升至81g/L,蛋氨酸对细胞增殖的限制作用也比较明显。
2.8 在高密度条件下进行流加当菌体密度达到120g/L,流加Ｌ＿蛋氨酸,速率为2g/h,流加5ｈ。发酵结果如图8所示。补加前体时已经达到很高的菌体密度(120g/L),Ｌ＿蛋氨酸加入后ＳＡＭ快速积累,在开始流加后的28ｈ后达到最高值。在流加后,菌体基本停止生长,最终生物量为132g/L,ＳＡＭ积累量达到4.98g/L。达到最高点后,分解趋势比较缓慢。
3 结论
在发酵法生产ＳＡＭ的过程中,Ｌ＿蛋氨酸是必需的前体,其补加量对ＳＡＭ的产量、含量以及生物量都有很大的影响。本文首先确定了补加Ｌ＿蛋氨酸的量不应低于0.7ｇ/10ｇ菌体干重。然后对五种补加策略的比较发现Ｌ＿蛋氨酸在菌体达到高密度以后再加入发酵体系,进行转化生产ＳＡＭ,可以避免Ｌ＿蛋氨酸对菌体生长的抑止。在菌体达到高密度条件下一次性补加蛋氨酸效果比较好,ＳＡＭ积累量达到4.31g/L,菌体干重达到130g/L。在高密度条件下流加效果最为明显,ＳＡＭ最高积累量为4.98g/L,生物量132g/L。比较图6和图8,可以发现,同样是高密度发酵,一次性补加前体Ｌ＿蛋氨酸ＳＡＭ积累量增高很迅速,在补加18ｈ后即达到最高点,达到最高点后分解趋势很明显。而流加前体Ｌ＿蛋氨酸,ＳＡＭ积累量增高缓慢,在流加结束后28ｈ达到最高点,达到最高点后分解也比较缓慢,原因可能是采用流加方式,ＳＡＭ积累比较慢,细胞对ＳＡＭ有比较好的适应能力。
