本站另注：L-苯丙氨酸已在国内江苏部分厂家有发酵工业规模化生产，但仍然推荐此文供大家研究参考，了解工艺配方和分析方法。
L-苯丙氨酸(L-phe)是人和动物体内不能合成的8种氨基酸之一,人们称其为必须氨基酸。L-phe在生物体内是转化成L-酪氨酸的原料,因而L-phe成为一些氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分。而且,L-phe是合成药物麦角胺、抗生物质和维生素B6的重要原料。同时,L-phe也是合成一些抗癌药物的中间体[1]。在食品工业中,L-phe最主要的用途是合成二肽甜味剂,俗称蛋白糖。基于L-phe广泛的应用前景,近年来L-phe成为氨基酸行业单品中产量增长最快的一种。目前,L-phe的生产方法有酶法、发酵法等,直接发酵法具有可利用廉价原料直接生产L-phe的优点,发酵法生产L-phe,国外报道产酸率为2.8%,L-phe在我国还未实现规模生产[2]。本实验对构建的重组L-phe基因工程菌E.coLiHB101. 进行发酵实验,研究了其发酵工艺条件及营养物质的流加对产物L-phe积累的影响。
1 实验材料与方法
1.1 发酵用菌株基因重组工程菌E.coLiHB101. 。
1.2 培养基
1.2.1 种子培养基 蛋白胨1%;氯化钠1%;酵母粉0.5%;葡萄糖2%;调pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素)。
1.2.2 发酵培养基 Na2HPO4·12H2O20g/L;Na-citrate6g/L;Na-gLutamate0.4g/L;酪氨酸0.6g/L;葡萄糖20g/L;Km40mg/L。
1.2.3 补料培养基 CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸500mg/L;葡萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28%。
1.3 培养方法1.3.1 摇瓶培养 250mL锥形瓶内装LB培养基25mL,接种菌种斜面后,于旋转摇床上,在37℃培养12h。
1.3.2 深层培养
在2L自控发酵罐(美国进口)中装入1L发酵培养基。灭菌后接入5%的摇瓶种子。通气量为1000L/L·min时,于38.5℃下搅拌培养。搅拌转速根据溶氧(DO)调节;使用28%的氨水调节pH=7.0±0.2;采用流加葡萄糖工艺补料,补料速率由测定葡萄糖来控制。
1.4 测定方法
1.4.1 菌体浓度
通过测定培养液或其稀释液在波长660nm处的吸光度OD660确定菌体浓度。一个OD660单位相当于0.267g/L(菌体干重)。当OD660<0.3时,有良好的线性关系。
1.4.2 残糖浓度
用费林试剂法测定[3]。
1.4.3 发酵液中L-phe浓度分析
用荧光法进行测定[4]。
2 结果与讨论
2.1 生长因子对苯丙氨酸积累的影响
通过添加不同浓度的酪氨酸,实验由图1示出:随着酪氨酸添加量的增加,产酸率提高,从发酵成本和产酸率两方面分析,得出酪氨酸的最适添加量为1.0～1.2g/L,既可得高产酸率3.68%,又可使成本不致过高。
2.2 工艺与代谢副产物乙酸对苯丙氨酸的影响
通过对发酵工艺条件优化,实验得出:当发酵温度控制在38～39℃,溶解氧(DO)控制在20%,在整个实验过程中葡萄糖浓度维持在1.5%,既有利于苯丙氨酸的积累,又能有效抑制乙酸的产生,苯丙氨酸的浓度可达到3.86%,结果见图2。
3 结 论
1)获得了L-phe发酵的优化工艺参数为:搅拌转速450r/min,发酵温度为38.5℃,DO控制在20%,发酵液pH值为7.0,糖浓度控制在1.5%,酪氨酸添加量为1.0～1.2g/L。另外,分析了上述工艺条件对菌体细胞生长和L-phe积累的影响。
2)溶氧控制的葡萄糖流加补料和酪氨酸分批补料双重调控可以有效地控制菌体比生长速度,减少乙酸产生,提高菌体浓度和L-phe浓度。
3)经十几批发酵条件的摸索和5批稳定发酵,该菌种重组质粒稳定,重复性好,平均产酸量36.8g/L。
参考文献:
[1] 林 锐.l-苯丙氨酸研究现状[J].微生物通讯,1992,26(2):15-18.
[2] 范代娣,李万华,张小燕,等.732H+离子树脂在l-苯丙氨酸发酵纯化中的应用[J].西北大学学报(自然科学版),2000,30(4):135-137.
[3] 张龙翔.生物化学实验方法和技术[M].北京:高等教育出版社,1981.
[4] 范长胜.荧光法测定发酵液中的苯丙氨酸含量[J].氨基酸杂志,1989,30(2):31-34.
