Ｌ-苯丙氨酸是人体必需的8种氨基酸之一,是临床医药氨基酸输液和食品添加剂的重要组成成分。近年来由于氨基酸类抗癌药物及抗病毒药物的开发应用,特别是甜味剂阿斯巴甜作为20世纪90年代国际市场最流行的甜味剂产品,使得市场对Ｌ-苯丙氨酸的需求激增[1]。
Ｌ-苯丙氨酸的工业化生产路线主要有发酵法和酶法。酶法具有产物浓度高、生产能力强等优点,是目前国内外Ｌ-苯丙氨酸的主要生产路线。其中苯丙酮酸酶法被认为是最经济、最直接的Ｌ-苯丙氨酸生产路线[3]。苯丙酮酸酶法路线成功的关键之一是转氨酶的高活性表达,该酶一般由微生物发酵产生,故不同的反应器类型影响到转氨酶的产酶量及活性,培养过程的能耗及效率也直接影响到生产成本。在以往的研究中发现,采用机械搅拌式生物反应器[3],尽管培养所得的转氨酶活性较高,但培养周期较长,培养成本也较高。
气升式反应器利用所通入的气体输入能量进行混和,与传统机械搅拌式发酵罐相比具有结构简单、能耗低、流场剪切力小的特点而得到广泛的关注[4]。文中设计了一种新型的气升式反应器,它有效地强化了反应器内氧的传递,减少了搅拌对微生物细胞的剪切作用,满足了微生物细胞的生长和产酶需要,提高了酶的产率、缩短了生产周期,降低了产酶成本。
1 实验材料与方法
1.1 实验用生物反应器
内循环气升式反应器:内外套筒均由硼硅玻璃组装而成,反应器体积1.5Ｌ,外套筒内径100ｍｍ,气体分布孔直径为1～1.5ｍｍ,高径比2.5∶1。
外循环气升式反应器:反应器由不锈钢制造,反应器体积15Ｌ,反应器直径100ｍｍ,气体分布器安装在循环管底部,由喷口直径2～3ｍｍ的喷嘴组构成。机械搅拌生物反应器,体积分别为1.5和15Ｌ。标准配制。
1.2 发酵菌种
大肠杆菌Ｎｏ.1,本研究室保藏。
1.3 斜面培养基
普通肉汤培养基。
1.4 种子及发酵培养基葡萄糖1.5%,蛋白胨1.0%,玉米浆2.0%,ＭｇＳＯ4 0.1%,酵母膏0.5%,ＫＨ2ＰＯ4 0.1%。ｐＨ7.0～7.5。
1.5 发酵培养条件反应器装液量为70%,培养基ｐＨ7.0,35～37℃培养15～20ｈ。
1.6 微生物生长及转氨酶比酶活的测定
生长光密度的测定:取样稀释25倍,用752可见紫外分光光度仪测定640ｎｍ处的吸光值。
转氨酶比酶活:以每毫升酶液在1ｈ内转化底物苯丙酮酸的摩尔数为相对酶活。
酶活计算公式:Ｅ=(Ｃ1-Ｃ2)×Ｖ1×1000/(Ｖ2×164)
其中:Ｃ1为底物的初始浓度;Ｃ2为反应后底物浓度;Ｖ1为底物体积;Ｖ2为酶液体积;164是苯丙酮酸的摩尔质量。
1.7 测量方法
苯丙酮酸的含量测定:Ｆｅ3+显色法,见参考文献[5]。
体积氧传递系数(ｋＬａ)的测量:采用动态电极法,见参考文献[6]。
2 实验结果与讨论
2.1 内循环气升式反应器结构与操作参数对传质与混合的影响
对于内循环气升式反应器,内外套筒的直径比、气体分布器的孔径是主要的结构参数,通气量是主要的发酵操作条件。良好的液体混合、较高的体积氧传质系数ｋＬａ是获得理想发酵结果的保证。以1.5Ｌ的玻璃反应器为例,笔者研究了反应器结构及操作参数对反应器传质的影响,结果见表1。
从表1可看出,随着内套筒直径和通气量的增加,反应器的混和时间及ｋＬａ值均随之上升但喷嘴直径影响不大,故实际发酵中采用的内套筒直径为60ｍｍ,喷嘴直径为1.5ｍｍ。
2.2 外循环气升式反应器结构与操作参数对传质与混合的影响
对于外循环气升式反应器,外循环的内径气体分布器的孔径是主要的结构参数,通气量是影响发酵的主要因素。针对15Ｌ的不锈钢反应器,对不同循环管的内径及气体分布器的喷嘴直径进行了考察,结果见表2。
从表2可发现,循环管内径对ｋＬａ的影响较大,而通气量和喷嘴的直径影响不大,故实际培养采用的循环管内径为50ｍｍ,喷嘴的直径为3ｍｍ。
2.3 内循环气升式反应器中转氨酶的发酵产酶结果
在1.5Ｌ的玻璃发酵罐中(内套筒直径为6ｃｍ,喷嘴直径1.5ｍｍ,通气量2ｍＬ/Ｌ)进行Ｌ-苯丙氨酸生产菌的发酵培养,菌体生长迅速,培养周期较机械搅拌罐有明显的缩短,转氨酶的酶活提高了20%(见表3)。
2.4 外循环气升式反应器中转氨酶的产酶结果
在15Ｌ的不锈钢外循环气升式反应器中进行Ｌ-苯丙氨酸生产菌的发酵培养,通气量1ｍＬ/Ｌ,菌体生长迅速,培养周期较机械搅拌罐有明显的缩短,转氨酶的酶活也相应提高了10%以上。
3 实验小结
通过对2种气升式反应器的结构参数及操作参数的研究,在1.5Ｌ内循环、15Ｌ外循环气升式反应器中进行了转氨酶的产酶培养,发现利用气升式反应器培养周期明显缩短,产酶的酶活有相应的提高,因此气升式反应器与传统的机械搅拌式反应器相比,有明显的优势,若进一步优化,可应用于Ｌ-苯丙氨酸的产业化。
