Ｌ-色氨酸在人体内不仅可以转化为5 ＨＴ、褪黑素、尼克酸等生理活性物质,并以此影响血压、痛觉、情绪、睡眠及神经内分泌活动,对于治疗抑郁症、失眠、高血压、肝性脑病、经前期紧张综合症、肝性脑病、震颤麻痹等有着十分重要的作用[1]。利用微生物直接发酵法生产Ｌ-色氨酸越来越受到人们的重视。先后有Ｏｓ ａｍｕＫｕｒａｈａｓｈｉ等[2 3]、ＩｓａｍｕＳｈｉｉｏ等[4]根据代谢控制发酵原理对Ｌ-色氨酸发酵进行了研究。补料分批发酵是指在发酵过程中,连续或间歇补加一种或几种培养基成分,但发酵过程中不取出发酵液的发酵方法。与分批发酵相比,补料分批发酵可降低发酵液中底物浓度及发酵液粘度,提高菌体对氧和营养成分的利用率,解除底物的抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖分解阻遏效应,从而更有利于目的产物的生成,达到较大幅度提高目的产物产量的目的。氨基酸补料分批发酵的研究报道[5 8]不少,本文对Ｌ-色氨酸的补料分批发酵进行了研究。
1 材料和方法
1.1 供试菌株
谷氨酸棒杆菌(Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ)ＴＱ2223(Ｐｈｅ-+Ｔｙｒ-+5ＭＴｒ+ＳＧｒ+5ＦＴｒ+ＣＩＮｒ),天津科技大学代谢控制发酵研究室保藏菌种。
1.2 培养基
(1)活化培养基/ｇ·Ｌ-1:葡萄糖1,蛋白胨10,牛肉膏10,酵母膏5,ＮａＣｌ2.5,琼脂20,ｐＨ7.0～7.2。
(2)种子培养基/ｇ·Ｌ-1:葡萄糖30,(ＮＨ4)2ＳＯ4 2.0,玉米浆30ｍＬ,豆饼水解液20ｍＬ,ＫＨ2ＰＯ4 1.0,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.4,ＭｎＳＯ4·Ｈ2Ｏ 0.01,ＦｅＳＯ4·7Ｈ2Ｏ 0.01,ＶＢ1300μｇ,ＶＨ200μｇ,ｐＨ7.0～7.2。
(3)发酵培养基/ｇ·Ｌ-1:葡萄糖80,(ＮＨ4)2ＳＯ442,Ｐｈｅ0.15,Ｔｙｒ0.15,豆饼水解液19ｍＬ,玉米浆22ｍＬ,ＫＨ2ＰＯ41.0,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.4,ＭｎＳＯ4·Ｈ2Ｏ0.01,ＦｅＳＯ4·7Ｈ2Ｏ 0.01,ＶＢ1100μｇ,ＶＨ50μｇ,补氨时(ＮＨ4)2ＳＯ4 60,ｐＨ7.0～7.2。
1.3 培养方法
(1)斜面活化培养:32℃培养(20～24)ｈ。
(2)种子培养:500ｍＬ三角瓶装液25ｍＬ,9层纱布封口,置于回旋式摇床上(220ｒ/ｍｉｎ),32℃振荡培养16ｈ。
(3)摇瓶发酵:500ｍＬ有挡板的三角瓶装液20ｍＬ,接种量10%,初始ｐＨ7.2,9层纱布封口,置回旋式摇床上(180ｒ/ｍｉｎ),32℃发酵72ｈ。发酵过程补料量为10ｍＬ。总装液量为30ｍＬ。补料次数、补料时间、每次补料体积随试验要求。
1.4 分析方法
(1)发酵液中残糖测定:采用ＳＢＡ-40Ｃ生物传感分析仪测定。
(2)ｐＨ的测定:用精密ｐＨ5.5—9.0试纸测定。
(3)发酵液中Ｌ-色氨酸含量测定:采用比色法测定[9]。
2 结果与讨论
2.1 流加(ＮＨ4)2ＳＯ4对发酵的影响
产物的积累随着菌体生长不断增加,在底物不断消耗的过程中,(ＮＨ4)2ＳＯ4过早耗尽,成为产酸进一步积累的限制条件。所以只要继续供给足够的氮源,微生物仍有能力再生成Ｌ-色氨酸。
2.1.1 初始(ＮＨ4)2ＳＯ4浓度对发酵的影响
保持葡萄糖总浓度(130ｇ/Ｌ)、初糖浓度(80ｇ/Ｌ)、(ＮＨ4)2ＳＯ4总浓度(60ｇ/Ｌ)不变,从发酵第24小时开始间隔6ｈ补加一次葡萄糖。考察了不同初铵浓度,在发酵第24小时一次性补加剩余硫酸铵的发酵工艺对产酸的影响。补铵后每瓶总装液量仍为30ｍＬ。实验结果见图1。
由图1可以看出,初铵浓度以20ｇ/Ｌ硫酸铵为好。初铵浓度偏低,发酵第24小时补铵量相对最高,补铵后与分批发酵的基质条件相差不大,仍属于在较高浓度铵盐环境下发酵,因而产酸量提高不明显:初铵浓度较高,发酵24ｈ的铵盐浓度仍较大,补铵后菌体仍处于较高浓度铵盐环境下发酵,因而产酸量亦相对较低。
2.1.2 不同(ＮＨ4)2ＳＯ4补加方式对发酵的影响
考察了初糖浓度(80ｇ/Ｌ)、初铵浓度(20ｇ/Ｌ)相同,而补铵次数、补铵时间不同对Ｌ-色氨酸发酵的影响。每瓶装液量为20ｍＬ,含(ＮＨ4)2ＳＯ40.4ｇ;每瓶补(ＮＨ4)2ＳＯ41.4ｇ,补糖、补氨总体积定为10ｍＬ。
方式Ａ于发酵第12小时一次性补加剩余的(ＮＨ4)2ＳＯ41.4ｇ;
方式Ｂ于发酵第12小时和24小时分2次补加(ＮＨ4)2ＳＯ4各0.7ｇ;
方式Ｃ于发酵第12、24、36小时分3次补加(ＮＨ4)2ＳＯ4各0.47ｇ:
方式Ｄ于发酵第12、24、36和48小时分4次补加(ＮＨ4)2ＳＯ4各0.35ｇ。实验结果见图2。
从图2可知,以补铵方式Ｄ即多次少量补铵、铵盐浓度维持在一定水平以下的发酵效果最好。
2.2 分次添加玉米浆对Ｌ-色氨酸发酵的影响
玉米浆中富含氨基酸且价廉,为了在同等发酵时间下比较发酵效果,当糖浓度降到(10～20)ｇ/Ｌ时补加葡萄糖液,继续发酵72ｈ。在发酵第16小时一次性分别添加7、10和13ｍＬ/Ｌ的玉米浆。不同玉米浆添加量对发酵的影响如图3所示。
从图3中可以看出,玉米浆添加量为10ｍＬ/Ｌ时Ｌ-色氨酸的产酸率最高。通过补加玉米浆,可在一定程度上提高发酵液的产酸率,但由于发酵中有机氮源过于丰富,会造成菌体的过度生长,泡沫过多影响溶氧,从而引起耗糖速度的明显加快,其结果是Ｌ-色氨酸对葡萄糖的转化率降低。
2.3 补加Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸对发酵的影响
2.3.1 Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸添加比例对Ｌ-色氨酸积累的影响
按1.2.3培养基改变Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸添加量,在不同的Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸的比例及添加量下发酵,结果如图4所示。
从图4可以看出,当Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸的添加比例为1∶1时,能得到一个适合Ｌ-色氨酸积累的Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸浓度范围。在这个范围内,Ｌ-色氨酸的积累表现为与Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸在低浓度成正比,而在较高浓度下成反比关系,较好地反映了Ｌ-色氨酸生物合成的代谢规律。因此可确定Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸的最适添加比例为1∶1。
2.3.2 一次添加方式时Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸添加量的确定
按Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸的添加比例为1∶1,一次添加量分别为100ｍｇ/Ｌ、200ｍｇ/Ｌ、300ｍｇ/Ｌ、400ｍｇ/Ｌ,从第16小时起每隔16ｈ取样测Ｌ-色氨酸的产量,结果如图5所示。由图5可看出,当一次添加量为300ｍｇ/Ｌ,发酵终止时,Ｌ-色氨酸的产酸率最高。因此可确定采用一次添加法时Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸的最佳添加量为各300ｍｇ/Ｌ。
2.3.3 Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸分次添加的研究
由图5可知,当Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸初始添加量为200ｍｇ/Ｌ时,16ｈ的发酵液中Ｌ-色氨酸积累量最高。因此,分次添加时,Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸初始添加量应确定为200ｍｇ/Ｌ。比较了从第16小时起每隔8ｈ补加不同量的Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸,结果如图6所示。
3 结 论
研究了在Ｌ-色氨酸低糖流加发酵过程中分别补加(ＮＨ4)2ＳＯ4、玉米浆及Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸对发酵的影响。确定了补加(ＮＨ4)2ＳＯ4时的最适初始浓度为20ｇ/Ｌ,分多次少量补加效果最好;玉米浆的最适添加量为10ｍＬ/Ｌ;此外还确定Ｌ-苯丙氨酸、Ｌ-酪氨酸的最适初始浓度为200ｍｇ/Ｌ,每8ｈ添加40ｍｇ/Ｌ,时产量最高。在发酵中期分次添加上述物质可以使Ｌ-色氨酸的产酸率最高达到12.1ｇ/Ｌ。
