廖湘萍1，彭其安2，王伟平2，吴思方2
（1.湖北轻工职业技术学院，2.湖北工业大学）
摘 要：对发酵法生产D-核酸生物合成途径、菌种选育、发酵条件等进行了综述。
关键词：D-核酸；合成途径；菌种选育：发酵条件
D-核糖存在于所有动物、植物和微生物细胞中，是生命遗传物质核糖核酸的重要组成部分，在食品、生化、医药等行业应用十分广泛。近几十年来，国内外学者对D-核糖的生产展开了深入的研究，目前，D-核糖的生产方法主要有三种：（1）水解法：从天然物质中分离，即提取核酸，然后经酸水解后提取核糖。此方法收率低、成本高，不适于大规模工业化生产。（2）化学合成法：采用L-阿拉伯糖、葡萄糖酸、葡萄糖、L-谷氨酸、D-木糖等原料通过异构化、电解等反应合成。化学合成核糖的方法逐渐盛行，并实现了工业化，但这些方法存在着工艺复杂、原料价格高、产生副产物、环境污染严重等不足之处。（3）微生物发酵法：以转酮酶（TKT）缺陷型的枯草芽孢杆菌作为生产菌种、葡萄糖等为原料，在合适的工艺条件下，将葡萄糖转化为核糖。微生物发酵法生产D-核糖是目前最经济、环境污染最小的一种方法，在菌种选育、代谢调控、发酵条件、分析方法及分离纯化等方面已取得了大量研究成果。但如何进一步降低成本、提高收率，是发酵法亟待解决的问题。作者在此对发酵法生产D-核糖的生物合成途径、菌种选育和发酵条件进行了综述。
1 D-核糖生物合成途径
D-核糖生物合成途径的生化反应及相关酶已由Cooper等于1958年完成鉴定。其生物合成途径如下：D-葡萄糖分子经过磷酸戊糖（HMP）途径的氧化阶段，通过几步氧化反应生成D-核糖-5’-磷酸。正常情况下，其在转酮酶、转醛酶的作用下生成色氨酸、苯丙氨酸、辅酶Q等代谢产物，不能累积核糖。当转酮酶失活时，D-核糖-5’-磷酸代谢受阻，才在胞外生成核糖。通常以枯草芽孢杆菌或短小杆菌通过诱变育种的方法获得转酮酶缺陷型菌株，从而累积核糖。
2 菌种选育
2.1 D-核糖高产菌株应具备的特征
D-核糖高产菌株应具有如下特征：
（1）转酮酶活性丧失。此为D-核糖产生菌必备的基本特征，该酶活性丧失使D-核糖-5，-磷酸代谢受阻，大量累积核糖。
（2）具有较高的葡萄糖脱氢酶或葡萄糖酸激酶活性。这是由于D-核糖合成过程中需要两个关键酶，即葡萄糖脱氢酶和葡萄糖酸激酶。
（3）芽孢形成能力丧失。这是由于D-核糖产生菌分泌出大量的核糖，消耗了大量碳源和能源，不能形成芽孢。
（4）耐高浓度D-核糖。在发酵后期，核糖产生菌因分泌出大量的核糖，会产生反馈抑制作用。高产D-核糖的菌株应具备耐受高浓度D-核糖的能力。
2.2 野生菌株
早在1951年，Simonart等在短密青霉菌的培养液中就观察到了D-核糖的累积。
1963年，Suzuki等报道，在较高浓度Mn2+、Fe2+、Zn2+等金属离子存在下，某种细菌可由葡萄糖发酵生成约5 mg•mL-1的D-核糖，若不添加这些金属离子，就不能累积D-核糖。1981年，味之素公司利用棒杆菌AJll553为菌种，在含葡萄糖、（NH4）2SO4、维生素及微量元素的培养基中，34℃ 通风培养120 h，发酵液中可累积8 g•L-1的D-核糖 。我国从20世纪90年代才开始发酵法生产D-核糖的研究，关于野生菌株产D-核糖，国内还未见文献报道。
2.3 突变菌株
最早由Sasajima等报道以枯草芽孢杆菌为出发菌，通过紫外线诱变，筛选出莽草酸缺陷型菌株，可以累积35 mg•mL-1的核糖。20世纪70年代初，为了深入研究转酮酶缺失与核糖生产之间的关系，Sasajima等用紫外线、化学诱变剂处理TKT缺陷型枯草芽孢杆菌，获得D-葡萄糖脱氢酶活力高且无芽孢生成的突变株，其D-核糖产量为72.3 g•L-1。2004年，Park等以枯草芽孢杆菌为出发菌，通过NTG诱变获得的一株转酮酶缺陷型突变株JYl（KCCMl0407），利用分批补料发酵法，在优化发酵条件下D-核糖累积达46.6 g•L-1。
我国对菌种的筛选一般采用选育转酮酶缺陷型菌株，通常选用紫外和化学复合诱变等方法，近年来已取得较大的进展。山西省生物研究所的王慕华等以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis B941为出发菌株，采用紫外诱变原生质体的方法，获得了4株在含有6.0%D-核糖的培养基上生长的D-核糖高产菌株，其摇瓶发酵产量达55.0 g•L-1左右，且产糖稳定，有望实现工业化生产。江苏省微生物研究所选育到一株枯草芽孢杆菌的莽草酸营养缺陷型突变株JSIM-1018，以其为出发菌株，通过甲基磺酸乙酯和紫外线连续、间断诱变处理，获得了一株次黄嘌呤、莽草酸双重营养缺陷型突变株No.271菌株。该突变株摇瓶发酵的D-核糖平均产量为108.1 g•L-1，在30 m3发酵罐中连续发酵5罐，平均产D-核糖96.4 g•L-1，最高为98.2 g•L-1。此产量达到了国际先进水平。
2.4 基因工程菌
传统的菌种诱变方法工作量庞大，具有很大的盲目性，当产量达到一定程度后很难再提高，而且不能把不同菌株的优良性状结合起来。利用基因克隆、体外DNA重组和转基因技术构建D-核糖工程菌，是近几年来发展的方向。Miyagawa等通过克隆葡萄糖操纵子构建D-核糖工程菌。首先用限制性内切酶EcoRI处理的噬菌体Zap感染大肠杆菌BIN，冉用标记核酸探针进行杂交，获得了具有高葡萄糖酸激酶活性的D-核糖生产菌Bacillus subtilisPGLS4，该工程菌可累积D-核糖62g•L-1，原亲株累积39g•L-l。
3 发酵条件
在D-核糖的发酵生产中，仅仅选育优良的突变株和工程菌还是不够的，只能说明它们具有获得D-核糖高产的潜能。若要实现高产，还需要控制适当的发酵条件，包括种子培养基、种龄、接种量、发酵培养基、发酵温度、pH值、通风等。
早在20世纪50年代，国外就开始了发酵法生产D-核糖的研究。目前，日本企业D-核糖的发酵生产水平已超过100g•L-1，处于世界领先水平。Kishimoto等利用突变株ATCC21951，在含3μg•mL-1色氨酸、10μg•mL-1酪氨酸的山梨醇培养基上，36℃.通风培养24h后，再转到含葡萄糖、玉米浆和适量盐类的培养基中，38℃连续培养55 h，可累积92.1 g•L-1的D-核糖。韩国首尔大学的Park等采用的种子培养基为（%）：酵母膏1.0、KH2PO4 0.5、K2HPO4 0.5、MgS04•7H2O 0.1、葡萄糖1.0，500 mL三角瓶装液200 mL，37℃，250 r•min-1摇床振荡培养。发酵条件：3.7 L发酵罐装液l L，37 ℃，600 r•min-1，pH值6.80 ±0.19。发酵培养基初始糖为20 g•L-1木糖和20 g•L-1葡萄糖。发酵22 h后，将200 g•L-1木糖和50g•L-1葡萄糖混合液以7.4 mL•h-1补料。最终得到D-核糖产量为46.6 g•L-1、产率为0.88 g•（L•h）-1，相当于用简单分批发酵方法的1.2～2.0倍。
国内天津科技大学王树庆等通过正交实验确定了最佳发酵条件，发酵培养基配方为：葡萄糖14%、玉米浆2.0%～2.5%、（NH4）2SO4 0.5%、CaCO32%、pH值7.0及适量酵母粉，500mL三角瓶装液40mL，往复式摇床38℃发酵72 h，摇瓶发酵D-核糖产量为39 g•L-1。顾晓波等研究了金属离子Mn2+、Fe2+、Zn2+对枯草芽孢杆菌转酮酶缺失突变株合成D-核糖的响。结果表明，Fe2+和Zn2+对D-核糖的生物合成无显著影响，只在较高浓度下才对D-核糖的合成稍有抑制；Mn2+浓度为0.6 mmol•L-1时，D-核糖产量最高，过高或过低的Mn2+浓度均不利于D-核糖的合成。赵丽丽等研究了不同的添加物对D-核糖产量的影响。由于D-核糖的合成为HMP途径，以D-葡萄糖酸为碳源发酵时，可以增加D-核糖的产量，当葡萄糖与葡萄糖酸钠比例为1∶1时，D-核糖产量最高达64.3 g•L-1；由于D-葡萄糖脱氢酶是D-核糖生物合成的一种限制酶，而Mn2+是D-葡萄糖脱氢酶的激活剂，实验证明：Mn2+含量为0.005%时，D-核糖的产量最高；此外，芳香族氨基酸中的酪氨酸、有机酸中的山梨酸能明显促进菌体的生长，并促进D-核糖的生成。
江西诚志生物工程有限公司高润香等优化了D-核糖发酵的调控方法，以控制溶氧、pH值为主线，以控制菌体的生长量、底物消耗速率及产物生成速率等关键变量为主要内容，采用流加补糖方法发酵。5000 L发酵罐的发酵结果表明，D-核糖产糖水平提高20%以上，发酵周期缩短至42～50 h，并获得专利。该公司的D-核糖生产能力已达到50 t•a-1，在今后几年内将把D-核糖的生产规模扩大到350 t•a-1。
从上述发酵工艺中可以得出：D-核糖发酵生产中，葡萄糖是最适合的碳源，硫酸铵是最适合的氮源，硫酸锰是最适合的无机盐。同时还要适量添加必需氨基酸，才能保证菌株的正常生长。在D-核糖发酵代谢控制过程中，控制溶氧、pH值和补料等发酵参数，尤其是适时添加碳源，不仅可缓解葡萄糖代谢阻遏效应，在发酵后期还可以减少残糖的含量、提高D-核糖的产率，降低生产成本。
4 展望
目前，全世界D-核糖产量大约为2000 t•a-1，D-核糖可作为合成维生素B2的原料，维生素B2每年的需求缺口达1.5万t左右；近年来核酸药物的发展，带动了由D-核糖合成抗癌、抗病毒等新药的研究，显示出很好的医用价值。目前D-核糖国际市场售价约30～40美元•kg-1，国内生产成本大约为150元•kg-1，经济效益较好，D-核糖具有广阔的市场前景。
