关键词：L-异亮氨酸；离子交换；提取；工艺条件
1前言
早在1936年，Rose等人根据动物营养试验结果证实，L-异亮氨酸为人和动物体营养必需氨基酸之一。它可作为强化剂添加于食品中，可用于配制一般营养复合氨基酸输液和治疗型特种氨基酸输液，其用量逐年增长IJl。目前，L-异亮氨酸主要是通过发酵法来生产，在L-异亮氨酸的发酵液中，除主要产物外还有其他氨基酸如丙氨酸、缬氨酸，因L-异亮氨酸跟这两种氨基酸均为中性氨基酸，它们的结构相似，等电点也接近，导致L-异亮氨酸分离非常困难。目前中性氨基酸的工业化分离方法国内外报道都不多，为了提高总提取率，作者采用离子交换法对L-异亮氨酸的分离提取进行了研究。
2实验部分
2．1 材料和仪器
001 X7(732)离子交换树脂，中国医药(集团)上海化学试剂公司。离子交换柱(φ20×500mm)，无锡仪器厂。L-异亮氨酸发酵液，江南大学生物工程学院氨基酸研究室提供。回转式恒温调速摇瓶柜HYG-II型，上海欣蕊自动化设备有限公司。PHs-3C型精密pH计，上海雷磁仪器厂。72 分光光度计，上海第三分析仪器厂。
2．2 发酵液预处理
在发酵液中加入草酸并加热至80℃，保温3min，离心除去部分菌体和碳酸钙，上清液用絮凝剂处理，过滤，根据物质颜色与吸收光颜色的互补关系，实验中采用650nm的入射波长，测定其透光率。
2-3 树脂的预处理
阳离子交换树脂依次用20％NaCl、2mol／LNaOH、2mol／L HCl浸泡洗涤，最后浸泡于去离子水中备用。
2．4 分析方法
L-异亮氨酸和L-丙氨酸含量的测定采用纸色谱定量分析法。即将待测液点样于新华3号层析纸上，电吹风加热赶氨，经展开剂(正丁醇：冰醋酸：水=4：l：1)展开后，用1.0％茚三酮丙酮溶液显色，剪下斑点加5ml 75％乙醇：0.2％ CuSO4.5H20=39：l的溶液洗脱，显色液在分光光度计的570nm波长下测吸光值，然后从标准曲线上查出氨基酸的含量。
2．5 静态吸附量和选择性系数的测定
准确量取经过预处理的lOml离子交换树脂和100ml一定浓度不同pH值的L-异亮氨酸发酵液，置于500ml的锥形瓶中。25"C下恒温振荡，直至平衡为止，测定平衡后发酵液中L－亮氨酸和L－丙氨酸的浓度，按(1)、(2)式计算树脂的吸附量Q及选择性系数KAB。Q=(Co-C‘)V／131.16W (1)式中，Co为起始发酵液中L-异亮氨酸的浓度(g／L)：C‘为平衡后发酵液中L-异亮氨酸的浓度(g／L),V为发酵液体积(L)； 为湿树脂体积(L)：l31.16为L-异亮氨酸分子量；Q为树脂交换容量(mol／L)。
2．6 动态吸附实验
将一定量的离子交换树脂装入玻璃交换柱中，通入已经预处理过的L-异亮氨酸发酵液，直至穿透液与茚三酮反应呈阳性为止，水洗后，用洗脱剂洗脱，分部收集流出液，确定最佳洗脱条件。
3结果和讨论
3．1 发酵液预处理工艺的确定
发酵液是含有大量菌体等固形物组成复杂的带有负电荷的胶体分散体系，同时具有亲水性和憎水性的胶体特性。如果采用带菌体的发酵液直接上柱，不仅给操作带来困难，而且影响产品的质量和收率，因此采用絮凝沉降的办法对发酵液进行预处理。壳聚糖是天然聚合物，具有无毒，易被动物消化吸收，对提高家禽的产蛋率和瘦肉率很有好处，用壳聚糖絮凝得到的菌体蛋白是很好的饲料添加剂。故本文采用壳聚糖为絮凝剂。以其处理后发酵液的透光率为考察指标，结果发现溶液pH和壳聚糖用量是影响絮凝效果的重要因素。
3．1．1 pH对絮凝效果的影响
溶液pH对絮凝作用的影响有两方面：一是影响菌体细胞表面带电情况：二是影响絮凝剂的电离程度和絮凝剂分子链伸展程度。发酵液pH对絮凝效果的影响可以看出pH为2时，絮凝效果最好。这是因为壳聚糖作为一线性含氨基的高分子氨基在酸性介质中质子化，表现出阳离子絮凝剂的性质。pH 值降低，壳聚糖阳离子絮凝剂的性质更加明显，然而当溶液的pH值太低时，会使壳聚糖溶解，反而影响絮凝的效果，另外pH值还会影响壳聚糖的架桥能力，因此pH值太高或太低对絮凝都不利，应该把发酵液控制在合适的pH值。
3．1．2 壳聚糖用量对絮凝效果的影响
壳聚糖用量对絮凝效果的影响可以看出在一定的pH值下，絮凝效果随絮凝剂用量的增加而增加，达到峰值后，又随絮凝剂用量的增加而降低，这与架桥絮凝机理一致 l： 当高分子絮凝剂覆盖微粒表面的部分接近50％时，其絮凝作用最佳； 当絮凝剂过量时，微粒表面全部被覆盖，已没有空余表面吸附起架桥作用的其他絮凝剂，又由于覆盖的絮凝剂带有许多亲水官能团，故反而起分散作用，这时悬浮液又变为稳定的分散体系， 因此絮凝剂过量反而使絮凝效果下降。
3．2 pH值对树脂交换容量和选择性系数的影响
发酵液pH是影响交换平衡关系的一个重要因素。通过静态实验，测定了不同pH下的离子交换容量可以看出pH为2时，树脂的交换容量最大，为0.882mol／L。在pH 由6降至2的过程中L-异亮氨酸以阳离子形式存在，使阳离子交换树脂的吸附量增加，但当pH继续降低时，溶液中[H+]增加，与L-异亮氨酸根离子发生竞争吸附，因此导致交换容量降低。
3．3 发酵液中L-异亮氨酸浓度对树脂交换容量的影响
配制不同浓度的L-异亮氨酸溶液，在pH为2的条件下测定树脂的静态交换容量，实验结果可以看出，随溶液中L-异亮氨酸浓度增加，树脂的交换容量增加，但在浓度大于0.16mol／L以后增加L-异亮氨酸浓度对交换容量的提高影响不大。
3．4 固定床操作工艺
上柱：经预处理后的发酵液调酸至pH为2上柱。另外固定床操作的一个重要参数是固液两相的接触时间，可以用BV／h表示，即每小时流经柱子的上样液为床体积BV（Bed Volume）的倍数。为了进行有效的交换，离子交换过程中必须使固液两相有充分的接触时间，如果液相流速增加，固液接触时间缩短，树脂与上样液来不及交换，就会导致交换区拉长，很快发生渗漏现象。通过实验上柱流速采用0.6BV/h。
水洗： 上柱后， 用适量的水洗。一般为上柱发酵液体积的l～2倍，水洗流速为1.0BV／h。
洗脱：本实验以O.1mol／L，0.2mol／L，O.5mol／L，lmol／L的氨水和0.2mol／L，O.5mol／L，O.8mol／L，1mol／L的NH4Cl作为洗脱剂进行洗脱。结果发现以氨水洗脱时，L-异亮氨酸与L-丙氨酸重叠较多，而以O.5mol／L的NH4Cl作为洗脱剂时，分离效果较好。
3．5 洗脱液的脱色与精制
本实验采用粉末状活性炭脱色。活性炭脱色是利用优先选择吸附有机大分子色素的特性，将色素分子强烈吸附于活性炭颗粒表面，随活性炭的分离而被除去。据文献报道，在偏酸性条件下活性炭脱色效果显著。因此本实验选定pH为4.5。并且通过多次实验，发现当活性炭用量为l％、温度为8O℃脱色lh，能达到较理想的脱色效果。
脱色液经旋转蒸发仪浓缩，加入乙醇结晶，于4℃静置过夜，过滤晶体，真空干燥12h，即得成品。成品总提取率为55％，高氯酸滴定法测得其纯度达98.8％ 。
4结 论
1．壳聚糖对L-异亮氨酸发酵液中的菌体具有良好的絮凝作用。溶液pH和壳聚糖用量是影响絮凝效果的重要因素。pH为2，壳聚糖用量为30mg／L时可获得良好的絮凝效果。
2．pH 2时最有利于732树脂吸附L-异亮氨酸。增加溶液中L-异亮氨酸浓度有利于增加树脂吸附量，但当L-异亮氨酸浓度大于O.16mol／L时，这种影响不明显。
3．L．异亮氨酸经732 树脂吸附，0.5mol／L NH4Cl洗脱后浓缩结晶得成品，成品总提取收率为55％。
参考文献
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