L一亮氨酸，又称白氨酸，化学名为a一氨基异己酸，1819年Proust首先从奶酪中分离得到，后来Braconnot从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶，并定名为亮氨酸。L一亮氨酸是常见十八种氨基酸中的一种，也是人体八种必需氨基酸之一，另外由于L一亮氨酸和L一异亮氨酸、L-撷氨酸的分子结构中都含有一个甲基侧链而被称为支链氨基酸(Branched chain amina acids, BCAA)。
1 L一亮氨酸的分子结构及其物理化学性质
L一亮氨酸分子式为C6H1302N，相对分子量131.18，分子结构为：
L一亮氨酸为白色结晶或结晶粉末，是一种非极性氨基酸，味微苦，溶于水，20℃、25℃时溶解度分别为23. 7g/L和24. 26g/L，乙酸(10.9g/L)、稀盐酸、碱溶液及碳酸盐溶液，微溶于醇( 0. 72g/L )，不溶于醚，加热到145^r 148℃时升华，293-295 0C时分解，比重1. 29(180C)，比旋光度[a ] D20为+14. 5^-+16. 0 (6mo1/L Hcl，C=1)，等电点5. 98。
2 L-亮氨酸的生产方法
氨基酸的制造是从1820年水解蛋白质开始的。1908年日本人Ikeda发现谷氨酸钠是鲜味的强化剂，开始了工业化生产氨基酸的历史。1957年日本开始运用微生物进行谷氨酸发酵生产，从此揭开了微生物发酵方法生产氨基酸的历史新篇章。20世纪六十年代左右，关于L一亮氨酸生物合成以及其代谢调节机制相继阐明。这为微生物发酵法生产L一亮氨酸定向育种及酶法生产L-亮氨酸提供了理论基础。
L一亮氨酸的生产方法主要有提取法、化学合成法、酶催化法、微生物发酵法等。
2.1 蛋白质水解法
氨基酸是蛋白质的组成单位，在酸性条件下，将L一亮氨酸含里较高的蛋白质水解，得到各种氨基酸的混合物，经分离、纯化、精致等工序获得L一亮氨酸产品。
我国大部分厂家采用蛋白质水解法生产L一亮氨酸。蛋白质水解法生产L一亮氨酸的优点是生产设备简单，技术要求不高，并且L一亮氨酸在蛋白质中的含量较高。但是蛋白质水解法生产的缺点是费时、污染严重、收率低、产品质量得不到保证，大规模生产受到限制。
2. 2 化学合成法
亮氨酸化学合成法有A.Strecker, n一卤代酸氨解、相转移催化等几种方法。虽然化学合成法原理简单，价格低廉，但操作复杂，反应条件苛刻，副产物多，产率不高，并且有的方法涉及到有毒物质。化学合成法得到亮氨酸是消旋的DL一亮氨酸，为了得到L一亮氨酸，必须进行光学异构体的拆分。因此化学合成法很少用于L一亮氨酸的生产。
2.3 酶催化法
酶催化法生产L一亮氨酸通常是利用转氨酶转氨给a一酮基异己酸生成L一亮氨酸.将相关的酶和NADH共价结合在膜上，让底物缓缓地经过膜而进行酶催化反应生成L一亮氨酸。如1981年，Wichmann er al.建立了一种用超滤膜制成的膜反应器，膜上共价结合了亮氨酸转氨酶、甲酸转氨酶、和NADH，当底物。一酮基异己酸通过膜反应器后，可被催化生成L一亮氨酸，其中NADH通过甲酸同步氧化成C02实现再生。
酶法生产氨基酸的优点是转化能力强，可避免代谢调控中的反馈抑制和反馈阻遏，并且其生物反应器紧凑，产物组分相对单一，易进行后工序加工处理，可以提高产品质量，降低成本。但酶法生产中所用到的酶需通过微生物发酵生成并提取精制，工艺过程比较复杂，且成本较高，因此目前尚未得到广泛的应用。如果能够低成本获得高酶活的酶，则酶法生产L一亮氨酸是一条经济可行的工艺路线。
2.4 微生物发酵法
2. 4. 1 添加前体物发酵法
1987年德国学者Groegere采用添加前体物。一酮基异己酸生产L一亮氨酸，当培养基中添加前体物。一酮基异己酸的浓度为20g/L，谷氨酸棒杆菌ATCC 13032发酵57h，可生成16g/L L一亮氨酸，质量转化率91-96%;而采用分批流加培养法，可流加a一酮基异己酸32 g/L，发酵23h，产L一亮氨酸24 g/L，从。一酮基异己酸到L一亮氨酸的转化是经过转氨酶的催化生成的。
2.4.2 直接发酵法
微生物直接发酵法生产L一亮氨酸是最具潜力的方法，国内外都有不少的研究。主要的生产菌株有:粘质赛氏杆菌(Serratea marcescens)、乳糖发酵短杆菌 ( Brevibacerium lactofermentum )、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum )、天津短杆菌 (Brevibacterim Tianjinese)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)等。
微生物发酵法生产L一亮氨酸最早见于1967年，Calvo报道的鼠伤寒沙门氏菌抗3-氟亮氨酸突变株发酵液中能积累少量的L一亮氨酸。1973年Kisumi选育的粘质赛氏杆菌(C S. marcescens )突变株在10%的蔗糖培养基中发酵积累L一亮氨酸10-13g/L:1975年，Tsuchida将乳酸发酵短杆菌(B.lactofermentum) 2255诱变的菌株No. 218 (2-TAr, I 1 e- )，可在13%的葡萄糖培养基中积累亮氨酸28g/LNo. 218菌株中已遗传性解除了L一亮氨酸对a一异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和反馈阻遏; 1986年Tsuchida又报道了经亚硝基肌诱变处理No. 218,筛选得到一株L一亮氨酸高产菌，该菌株在13%的葡萄糖培养基中积累能L一亮氨酸34g/L，并遗传性解除了三种支链氨基酸对a-乙酞经基酸合成酶的协同反馈阻遏。
国内有关L一亮氨酸微生物发酵法生产最早见于1979年，张素珍等选育的钝齿棒状杆菌(C. crenatum) AS1. 542经亚硝基肌连续诱变得到突变株AS1. 1004，旋转式摇床上28℃发酵96小时，产L一亮氨酸14g/L，在此基础上，1989年采用化学药物处理及快中子照射，获得一高产突变株，产酸20g/L。宫锦萝利用亚硝基肌诱变处理黄色短杆菌，摇瓶发酵产酸达13. 5 g/L。 1993年齐秀兰等报道，利用紫外线、利福平、氯化铿诱变黄色短杆菌的原生质体，筛选得到L一亮氨酸高产菌株，并对其进行发酵条件的优化，摇瓶产酸可达24. 5 g/L o 1994年刘党生筛选到一株a一氨基p一轻基戊酸和利福平抗性菌株，摇瓶产酸可达32. lg/L。
目前国内L一亮氨酸的生产主要是从天然蛋白质水解液分离提取，而以微生物直接发酵法生产L一亮氨酸还处于小试研究。因此，选育优良的L一亮氨酸生产菌株是实现发酵法工业生产L一亮氨酸的基础。
3 L一亮氨酸的代谢控制育种
L一亮氨酸发酵是典型的代谢控制发酵，L一亮氨酸的积累建立于对微生物中L-亮氨酸合成途径正常代谢调节的解除。也就是说，亮氨酸发酵的前提和关键在于是否能通过分子遗传学方法和生物化学方法，在DNA水平上改变和控制菌株的代谢，选育出解除与L一亮氨酸有关的调节机制的突变株，从而大量生成和积累L一亮氨酸。
3. 1 L一亮氨酸高产的基本思路
氨基酸发酵属于典型的代谢控制发酵，代谢控制发酵的成败取决于微生物细胞自我调控机制是否能够被解除和解除的效果。获得积累目的产物的突变株最有效的方法是通过基因突变解除微生物的正常代谢控制。获得突变株常用的几种方法如下:选育营养缺陷型菌株，切断或改变平行代谢途径:选育抗结构类似物突变株解除反馈抑制和阻遏:选育细胞膜通透性突变株，使目的产物分泌到细胞外，使细胞内终产物的浓度达不到引起反馈调节的浓度;应用基因工程、代谢工程的手段有目的改造微生物菌株，使其高浓度合成目的产物。
对于L一亮氨酸生产而言，(1)切断与L-亮氨酸合成途径平行的相关支路，这样既能解除支路终产物的反馈调节，也能增加前体物向L一亮氨酸支路的流量;(2)增加L一亮氨酸前体物磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸和a一酮基异戊酸、a一酮基异己酸:(3)解除L一亮氨酸对代谢途径中关键酶的反馈调节，则菌株就不再受L一亮氨酸正常反馈调节作用的影响，使终产物L一亮氨酸积累;(4)切断L一亮氨酸向其它物质转化的途径，即菌株不能继续分解利用L一亮氨酸:(5)生成的L一亮氨酸能及时地分泌到胞外。
3. 2 选育L一亮氨酸高产菌株的策略
根据L一亮氨酸的生物合成途径、代谢调节机制及实现L一亮氨酸积累的基本思路，定向选育L一亮氨酸高产菌的策略有：(1)选育L一蛋氨酸缺陷型(Met-)和L一异亮氨酸缺陷型(Ile-)磷酸烯醉式丙酮酸向L一蛋氨酸、L一异亮氨酸转化的这条支路就可减弱，而加大磷酸烯醇式丙酮酸向L一亮氨酸的另一前体物丙酮酸转化的代谢流;(2)选育丙氨酸缺陷型(Ala-)，丙酮酸转化成丙氨酸的途径非常短，且可通过多种酶转化成丙氨酸，因此丙氨酸缺陷型的选育非常重要，否则很大一部分丙酮酸流向了丙氨酸，进而影响最终L一亮氨酸的积累;选育异亮氨酸营养缺陷型菌株，仅仅解除了异亮氨酸对L一亮氨酸合成途径中第一个关键酶乙酞乳酸合成酶的部分反馈抑制和阻遏，但酶分子的结构和酶的合成调节没有改变，仍然受L一亮氨酸的反馈调节。L一亮氨酸的合成途径中第二个关键酶a一异丙基苹果酸合成酶，同样受到L一亮氨酸的反馈抑制和阻遏。如果解除L一亮氨酸对这两种关键酶反馈调节，菌体才有可能大量积累L一亮氨酸。筛选解除终产物的反馈调节最有效的方法就是选育抗结构类似物突变株((3)通过选育抗三种支链氨基酸结构类似物的突变株来获得解除三种支链氨基酸对乙酞乳酸合成酶系反馈调节的菌株。选育抗L一亮氨酸结构类似物突变株，可获得解除L一亮氨酸对a一异丙基苹果酸合成酶反馈抑制和对酶系反馈阻遏的突变株。因此可以推理出L一亮氨酸高产菌所可能带有的遗传标记为L一蛋氨酸缺陷(L-Met-), L一异亮氨酸缺陷(L一I1e-), L一丙氨酸缺陷(L-Ala-)、磺胺胍抗性(SGr )、亮氨酸氧肪酸盐抗性(LeuHxr), 2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)和p一轻基亮氨酸抗性( -HLr)、撷氨酸抗性(L-Valr)等。
3. 3 基因重组技术在氨基酸育种中的应用
随着工业微生物育种技术的不断进步以及分子生物学的飞速发展，菌株选育己由随机性、非定向性选育向有目的的定向选育发展，育种效率有了明显提高。目前获得L一亮氨酸高产突变株常采用的育种技术主要有诱变、细胞内基因重组、体外重组DNA技术等。诱变一直是育种的最基本技术，许多产酸菌株都是通过诱变得到的。除了诱变菌体细胞，用诱变剂直接诱变原生质体，由于原生质体对外界因素的影响更加敏感，可取得较好的诱变效果。
在分子水平上研究与L一亮氨酸代谢有关的酶的调节机制，用于指导基因工程手段构建L一亮氨酸发酵新菌株是一种较有前途的方法。如吴其威运用鸟枪法克隆L一亮氨酸合成的有关基因，构建了L一亮氨酸基因菌，经过发酵后，发酵液中有L-亮氨酸积累。其中基因供体菌是天津短杆菌，克隆受体菌为大肠杆菌。L一亮氨酸的生物合成途径较长，涉及到许多步骤和多种关键酶，因此克隆关键酶基因难度较大，所需要的技术水平较高。
4 L-亮氨酸的应用
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，在生物体内具有特殊的生理功能，参与细胞中多种化合物的合成代谢，是生物体内不可缺少的营养成份。自然界存在的氨基酸有一百多种，构成人体蛋白质的氨基酸只有20种，其中有8种必需氨基酸，L-亮氨酸是其中之一，从营养学的角度来讲，评价一种蛋白质营养价值的高低主要看这种氨基酸的含量和种类，营养学中的完全蛋白，L一亮氨酸所占份额最高，所以说L一亮氨酸是一种非常重要的氨基酸。广泛应用于医药、食品、调味剂、动物饲料及化妆品的制造等许多行业。
首先，在医药行业，L一亮氨酸是临床选用的复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料，对于维持危重病人的营养需要，抢救患者的生命起着积极的作用。亮氨酸还在调节氨基酸与蛋白质代谢方面起重要作用。Mortimore和Reeta Poso研究发现，亮氨酸是骨骼肌与心肌中唯一可调节蛋白质周转的氨基酸。Tischler与Garlick等的研究表明，亮氨酸能促进骨骼肌蛋白质的合成。亮氨酸的代谢产物a一酮异己酸也具有调节蛋白质代谢的作用。在氨基酸静脉注射液以及作为补品的氨基酸口服制剂中，L一亮氨酸都占有较大的比重。
支链氨基酸是一类具有特殊功能的氨基酸，其生理功能是近年来临床应用研究的热门课题。除用于合成蛋白质外，还有其独特的营养生理作用。首先在特殊生理时期(如饥饿、泌乳、运动)支链氨基酸是体内重要的能量来源，支链氨基酸的氧化速率较快，在体内分解产生ATP的效率高于其它氨基酸，因此在特殊生理时期能氧化供能，可以用来补充大运动量引起的能量消耗，减轻由此引起的中枢神经系统的疲劳反应，减少高强度运动造成的蛋白质分解。
其次，支链氨基酸在调节氨基酸与蛋白质代谢方面起重要作用，而三种支链氨基酸中，对蛋白质代谢起主要调节作用的是亮氨酸，异亮氨酸和撷氨酸对蛋白质的合成和降解无显著影响。支链氨基酸还能够刺激肌肉中蛋白质的合成，有助于皮肤、骨骼和肌肉的成长。研究表明支链氨基酸对ALS(肌萎缩性侧缩硬化，又称运动神经元病)有辅助治疗作用，还可用于治疗肝性脑病，Fischer于1976年证明用含有丰富支链氨基酸(撷氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)的溶液对纠正肝性脑病患者的血浆氨基酸不平衡，改善患者的肝功能损害和蛋白营养不良是非常有效的。L一亮氨酸在医学上，还可用于论断和治疗，突发性高血糖症，治疗肝昏迷等。L一亮氨酸还是许多重要物质合成的前体物。以L一亮氨酸为前体物合成的乙酞-L一亮氨酸和乙醇酷可作为头晕治疗及营养滋补类药物。L一亮氨酸硫酸锌复合体系在医药、食品、化妆品中有广泛的应用。可用于L一亮氨酸Schiff碱金属配合物具有抗癌、抗病毒、抑制细菌生长等生物活性功能，更是引起了各界人士的注意。另外，选用L一亮氨酸作为氨基酸部分的N一稀有脂肪酸基一L一亮氨酸具有较高的抗菌活性。L一亮氨酸与稀土配合物是氨基酸肥料和农药的一种，不仅能增产、防止农作物病虫害，并且能被日光和微生物降解，是目前深受人们喜爱的“绿色农药”。这种农药的降解产物还可促进农作物对微量元素的吸收利用，增加产量，改善作物的品质。
国内氨基酸工业发展较晚，起步较低，技术落后，并已出现了氨基酸工业发展不平衡，某些氨基酸供给大于需求，氨基酸生产成本降不下来，价格贵，并且产品质量上不去，大部分生产的氨基酸都只能用在饲料的生产上，质量达不到药品级，因此国内许多氨基酸都迫切需要高品质、低成本生产。因此，加强研究开发力度和正确的市场引导，注重上下游配套技术的研究，为保证我国氨基酸行业的健康发展具有重要的意义。
