异亮氨酸(2-amino-3-methylvalericacid)由Ehrlich于1904年首次从甜菜糖浆中分离出来,其化学组成虽与亮氨酸相同,但理化性质各异,故命名为异亮氨酸。异亮氨酸有4种光学异构体,自然界中存在的仅为L-异亮氨酸。
哺乳动物体本身不能合成L-异亮氨酸,所以,作为人体必需的8种氨基酸之一,成年人每天需要从外界摄取20mg/kg(体重)的L-异亮氨酸。L-异亮氨酸是合成人体激素、酶类的原料,具有促进蛋白质合成和抑制其分解的效果,在人体生命活动中起着重要作用,因此,在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。食品方面,主要用于食品强化,使各种氨基酸平衡,提高食品的营养价值。在医药方面,3种支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)组成的复合氨基酸输液以及大量用于配置治疗型特种氨基酸的药物,如肝安、肝灵口服液,对治疗脑昏迷、肝昏迷、肾病等具有显著疗效,并可取代糖代谢而提供能量,是比较昂贵的氨基酸原料药之一。近年来的研究表明,L-异亮氨酸是一种高效的B2防御素表达的诱导物,在诱导上皮防御素表达上起着重要作用,作为一种免疫刺激物,对粘膜表面的防御屏障在临床上将起到重要的支持作用。由于L-异亮氨酸和L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基,是新型低分子量凝胶,不仅可以使纯水和含有无机酸和盐的水溶液成凝胶而且可以使有机溶剂和油成胶状,可以制备形成水凝胶,其在生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域已被广泛运用。在国外,还将其大量用于乳牛催乳以及饲料添加剂,以及将L-异亮氨酸添加到饮料中生产功能饮料等。
1 L-异亮氨酸的生产方法
过去氨基酸都是以酸水解蛋白质制造,自1956年日本协和发酵公司用发酵法生产谷氨酸以后,氨酸的发酵生产发展很快,到目前为止,绝大多数氨基酸已能用发酵法和酶法生产。L-异亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法、发酵法。提取法和化学合成法由于原料来源受限制,生产成本高,污染环境,难以实现工业化生产。微生物发酵法生产L-异亮氨酸具有原料成本低,反应条件温和,容易实现大规模生产等优点,是目前生产L-异亮氨酸最主要的方法。L-异亮氨酸发酵有添加前体发酵(又称微生物转化法)和直接发酵-种方法。早期,异亮氨酸发酵是利用芽孢杆菌(Bacillus)、沙雷氏菌(Serrati)、假单孢菌(Pseudomonas)等使用葡萄糖等作为发酵碳源、能源,再添加特定的前体物质如A-氨基丁酸、A-羧基丁酸、D-苏氨酸、A-酮基异戊酸等,以避免氨基酸合成途径的反馈抑制,经微生物作用将其有效地转变为异亮氨酸。直接发酵法是借助微生物具有合成自身所需氨基酸的能力,通过菌株的诱变处理,选育出各种营养缺陷型和氨基酸结构类似物抗性突变株,如黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、谷氨酸棒杆菌(Corynebac-teriumglutamicum)、粘质赛氏杆菌(Sarratiamarcescens)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofer-mentum)、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、大肠杆菌(Escherichiacoli)等,以解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏,达到过量积累L-异亮氨酸的目的。
2 L-异亮氨酸的生物合成途径及调节
2.1.1 L-异亮氨酸的生物合成途径
以葡萄糖为原料生物合成L-异亮氨酸涉及到EMP、HMP、TCA、乙醛酸循环、伍德沃克曼反应,以及苏氨酸合成水平和分支链氨基酸合成水平的调控制,其生物合成途径如图1所示。
2.1.2 L-异亮氨酸的生物合成及代谢调控
L-异亮氨酸生物合成的基本调节机制有反馈控制和在合成途径分枝点处的优先合成。在它的生物合成的主代谢流中,有5个关键酶控制其强度,它们分别受不同的代谢产物的反馈调节,活化这些酶有利于异亮氨酸的生物合成。
(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PC,EC41111138)
PC是介于合成和分解代谢物定向途径上的第1酶,受天冬氨酸、苹果酸的反馈抑制,受天冬氨酸、谷氨酸的反馈阻遏,为乙酰CoA、GDP、GTP或二磷酸果糖所激活。
(2)天冬氨酸激酶(AK,E1C12171214)
AK受苏氨酸和赖氨酸的协同反馈抑制。通过选育赖氨酸营养缺陷型切断由天冬氨酸半醛向赖氨酸的合成途径,使代谢流更加畅通,积累中间代谢物苏氨酸,从而使终产物L-异亮氨酸积累。
(3)高丝氨酸脱氢酶(HD,EC1111113)
HD受苏氨酸的反馈抑制和蛋氨酸的反馈阻遏。通过选育苏氨酸结构类似物(AHV、ThrHx)抗性突变株、蛋氨酸结构类似物(Eth)抗性变株或者蛋氨酸缺陷型可活化该酶。
(4)苏氨酸脱氨酶(TD,E1C141211116)
TD是异亮氨酸生物合成途径的第1个限速酶,受异亮氨酸的反馈抑制。筛选异亮氨酸结构类似物如乙硫氨酸(Eth)、异亮氨酸氧肟酸(IleHx)、缬氨酸结构类似物A-氨基丁酸(A-AB)等抗性突变株可以遗传性的解除异亮氨酸对苏氨酸脱氨酶的反馈抑制,有利于积累L-异亮氨酸。
(5)乙酰羟酸合成酶(AS,E1C141113118)
AS是异亮氨酸合成途径的第-个限速酶,受缬氨酸的反馈抑制以及缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的多价反馈阻遏。筛选缬氨酸结构类似物如A-氨基丁酸(A-AB)、2-噻唑丙氨酸(2-TA)等抗性突变株来活化该酶。
在谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸过程中,谷氨酸比天冬氨酸优先合成,谷氨酸在细胞内积累到一定浓度后,反馈抑制谷氨酸脱氢酶,使细胞的代谢转向天冬氨酸。在黄色短杆菌发酵生产L-异亮氨酸过程中,蛋氨酸优先合成,蛋氨酸过剩时,会反馈阻遏高丝氨酸转乙酰酶的合成,转而合成苏氨酸和异亮氨酸。天冬氨酸合成异亮氨酸的初始酶天冬氨酸激酶受赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制,因此切断向赖氨酸的合成途径,可以积累中间代谢物苏氨酸,于是终产物L-异亮氨酸积累浓度增加。
3 异亮氨酸的代谢调控育种
3.1.1 代谢调控育种机理
异亮氨酸发酵过程是典型的代谢控制发酵,以生物化学和遗传学为基础。研究代谢产物的生物合成途径和代谢调节机制,选择巧妙的技术路线,通过遗传育种技术获得解除或绕过微生物正常代谢的突变株,从而人为地使有用产物选择性地大量合成和积累。苏氨酸是异亮氨酸的前体物,设法解除对苏氨酸生物合成的反馈控制,增强苏氨酸的生物合成,可以增加异亮氨酸的积累。另外,通过切断支路代谢选育营养缺陷型突变菌株,或通过解除反馈调节选育结构类似物抗性突变株,均可提高产生菌积累异亮氨酸的能力。例如,蛋氨酸是异亮氨酸合成支路的代谢物,比苏氨酸优先合成,即蛋氨酸合成过量后才能使代谢流转向合成苏氨酸,进一步合成L-异亮氨酸。选育蛋氨酸营养缺陷型可切断合成蛋氨酸的支路,提高菌株L-异亮氨酸的合成能力。利用氨基酸结构类似物如A-氨基-B羟基戊酸(AHV)、异亮氨酸氧肟酸(IleHx)、A-氨基丁酸(A-AB)等抗性突变株解除L-异亮氨酸代谢过程中的反馈抑制,可提高L-异亮氨酸的积累。
3.1.2诱变选育
唐任天等以钝齿棒杆菌AS11542为出发菌株,经亚硝基胍(NTG)诱变,获得AHV抗性突变株AS11998,L-异亮氨酸产量达到14g/L。张伟国以黄色短杆菌ATCC14067为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)、NTG和紫外线(UV)复合诱变处理,定向筛选,获得1株L-异亮氨酸高产菌ZQ24,经摇瓶发酵,产量可达28~30g/L。宋文军等用黄色短杆菌II经DES诱变,定向选育具Metr+Ethr+a-ABr+AECr遗传标记的目的突变株ISW330,获得摇瓶发酵产L-异亮氨酸20.2g/L的高产菌株。Ikeda等以产L-苏氨酸11g/L的L-苏氨酸产生菌FAB-3-1为亲株,选育乙硫氨酸(Eth)抗性突变株,获得几乎不积累L-苏氨酸的L-异亮氨酸高产变异株,L-异亮氨酸产量达3315g/L。表明Eth可以解除异亮氨酸对TD的反馈抑制,促进异亮氨酸的积累。
3.1.3 生物工程菌胜亦等用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌的穿梭载体,以野生型谷氨酸棒杆菌T106的染色体DNA为供体,克隆了与T106的高丝氨酸缺陷株RRL5011(HD缺失互补的SaDNA片段,获得pCHom17,将它导入谷氨酸棒杆菌产生菌TDA--5,异亮氨酸产率由416g/L提高到814g/L。岩木盾等从大肠杆菌中分离出异氨酸操纵子,然后克隆到质粒PBR3--中,将重组质粒再转化到异亮氨酸缺陷突变株中,获得异亮氨酸工程菌WSI-99,异亮氨酸可积累-8g/L。小野将异亮氨酸操纵子克隆,然后对重组质粒进行体外羟胺诱变,将处理后的重组质粒转化为大肠杆菌C600,获得带有异亮氨酸氧肟酸抗性的工程,异亮氨酸产量可达32g/L。Sahm等利用DNA重组技术,从C1glutamicum中克隆编码苏氨酸脱水酶基因,得到携带抗反馈苏氨酸脱水酶的突变,使同基因的Clglutamicum菌株所产L-苏氨酸转变成L-异亮氨酸,L-异亮氨酸达到30g/L。S1Guillouet等将苏氨酸高产菌ClglutamicumATCC21799携带质粒pAPE20,表达苏氨酸脱水酶,使碳流向异亮氨酸合成的方向,在4L发酵罐中异亮氨酸最高产量可达40g/L。
4 L-异亮氨酸发酵的工艺控制
代谢控制育种和发酵过程的代谢过程培养是实现代谢控制发酵的两个重要手段。
4.1.1 培养基
发酵培养基的成分和配比是决定菌体代谢的主要因素,对异亮氨酸的产量及提取收率有很大的影响。在异亮氨酸发酵中,葡萄糖是最常见、最主要的碳源,糖蜜、A-溴丁酸等也可作为碳源。A-氨基丁酸、A-羧基丁酸、DL-苏氨酸、A-酮丁酸常作为发酵前体物。氮源一般以硫酸铵、尿素等为无机氮源;玉米浆、豆饼水解液等作为有机氮源。异亮氨酸产生菌大都是生物素缺陷型,因此,有机氮源也是异亮氨酸发酵中生长因子生物素的重要来源。使生物素的浓度处于合适的水平,是异亮氨酸发酵生产中的一个关键。在异亮氨酸生产中,采用尿素或者氨水为氮源,还可以调节pH值。磷酸盐在菌体代谢中起到与ATP等进行能量转化和合成菌体的作用,强化电子传递系统,使NAD(P)H生成和消耗更快,有利于代谢流转化,控制适量的磷酸盐有利于产酸。金属离子如镁离子、锰离子和钾离子是作为某些酶的激活剂;铁离子是细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶的活性基的组成成分;钠离子则在培养基中起调节渗透压的作用,因此适量浓度的金属离子在异亮氨酸生物生产中有着重要的作用。
4.1.2 pH值和温度的影响
pH值对异亮氨酸的影响主要是酶活性和菌的代谢活力。控制pH值有流加尿素和流加氨水-种方法。流加氨水的浓度通常为14%、25%、28%。氨调pH值作用快,但不宜控制。流加尿素要求少量多次,但可使pH值比较稳定。发酵前期pH值控制在614~616,中后期控制在617~619。在发酵过程pH值不能超过710,超过710,直接会影响发酵产酸的水平。温度影响菌体生长和产物积累。L-异亮氨酸发酵属于生长部分耦联型,菌体生长达到一定程度后才开始产生异亮氨酸,因此菌体生长最适温度异亮氨酸合成最适温度是不同的。许正宏等提出了变温控制理论,前期温度控制在31e,可以有效的缩短菌体生长的迟滞期,有利于菌体生长;后控制在28e,菌体内产L-异亮氨酸合成酶系活性较强,利于L-异亮氨酸的合成并减少其它杂氨基酸的形成。
4.1.3 溶氧与发酵的关系
发酵过程中溶氧由通气量、转速、罐分压决定,氧饱和度一般控制在10%~30%。L-异亮氨酸发酵是处于一类(供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵)和三类(在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵)发酵之间的二类发酵。常高峰等通过测定不同罐分压、转速、通气量影响下的体积传递系数KLA值发现,过高的KLA使发酵中后期代谢流发生迁移,产生副产物如丙氨酸、谷氨酸等杂酸;KLA过低时,产生缬氨酸等杂酸,导致L-异亮氨酸产量低,同时产生有机酸如乳酸、丙酸等对菌体产生抑制作用,而且不利于菌体产异亮氨酸。由于L-异亮氨酸碳骨架由丙酮酸提供,而丙酮酸到异亮氨酸的合成中必须经过TCA和He-TPP两个途径,前者要求溶氧高,后者要求溶氧尽量低一些,因此,采用分阶段溶氧控制模式有利于L-异亮氨酸的大量积累。
4.1.4 补 料
在L-异亮氨酸发酵模式中有分批式、流加式、半连续式,其中流加模式应用较多。流加式发酵,即补料-分批发酵,需在分批发酵过程中补入新鲜的料液如葡萄糖、磷酸盐、豆饼水解液等,以克服由于养分不足,导致发酵过早结束。高浓度葡萄糖对菌体生长起抑制作用,且灭菌时葡萄糖易被破坏生成有害物质,因此,发酵过程中要补加葡萄糖。浦军平等报道,L-异亮氨酸发酵初糖浓度控制在15%~16%之间,发酵过程中再适当补加1%的糖,30t发酵罐中L-异亮氨酸产量达13%~-15%。L-异亮氨酸发酵过程中随着菌体生长和L-异亮氨酸的产生,使磷酸盐大量消耗而浓度降低,因此在发酵中要补加磷酸盐,使其维持一定的浓度。
6 国内外生产现状
国际上氨基酸生产厂家主要有日本味之素、协和发酵、田边制药以及德国Degussa等4家公司,均以发酵法生产。日本在L-异亮氨酸产量、品质和技术水平均居世界领先地位。L-异亮氨酸产酸率为35g/左右,提取率在70%。日本味之素公司占有全球医药及食品用氨基酸市场60%的市场份额,味之素公司巴西分公司也将于-006年正式生产异亮氨酸。我国异亮氨酸生产规模较小,菌株产酸水平低发酵罐分批发酵水平在25g/L左右,提取率为50%左右,生产工艺、生产水平和生产设备远远落后于日本等国,产量不能满足市场需求。1990年代,L-异亮氨酸世界年产量在400t左右,而我国则大部分依赖进口。近年来,随着国内各生产厂家产量的增加我国异亮氨酸的产量逐渐可满足国内的需求,还有部分产品出口。国内的生产厂家主要有湖北宜药集团公司宜昌三峡药业有限公司、无锡晶石氨基酸公司(年产120t药用异亮氨酸)、南宁安力泰药业有限责任公司(年产量100t)等。国内氨基酸行业应该高度重视生物化工技术的应用,尽快解决目前L-异亮氨酸发酵周期长、分离提纯技术落后、产品收率低和产品质量不高的问题,并开展异亮氨酸在新领域的应用研究,以促进我国L-异亮氨酸产业的发展。
