自然界中存在少数微生物在适宜条件下能将碳水化合物、碳氢化合物转化为油脂而大量贮存,菌体油脂含量最高可超过其干重的70%[1]。已知细菌、酵母、霉菌、藻类中都有能积累油脂的菌株,但以酵母菌和霉菌类真核微生物居多[2]。利用微生物生产油脂不受季节和气候的影响、生产原料来源广泛、生产周期短、产品高值化潜力大,工业化前景看好[3]。当前化石资源贮量的日益减少,全球范围能源供应形势日趋严峻。通过酶催化和微生物发酵转化基于碳水化合物的可再生资源生产能源产品和化学品,已成为社会经济可持续发展的迫切要求。利用微生物生产油脂是开发新油脂资源的重要方向[4]。
本文对10株产油酵母利用木质纤维素水解液中主要单糖(葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖)的产油特性进行了初步筛选,表征了菌油中长链脂肪酸的组成。产油酵母菌的这些特点有利于充分利用木质纤维素水解混合糖,在开发生物质能源产品)生物柴油和其它高附加值生物化工产品中具有重要作用。
1 材料与方法
1.1 菌 种
本文筛选的菌株(表1)均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
1.2 主要试剂
D-葡萄糖(AR)、L-木糖(99.5%)、L-阿拉伯糖(99.5%)。其它有机溶剂均为分析纯。
1.3 主要仪器设备
TMQ.R3/5070型自动台式灭菌器,山东新华医疗器械股份有限公司。KND-2C型定氮仪,上海纤检仪器有限公司。HZQ-Q型全温振荡器,哈尔滨东联电子技术开发有限公司。Re-3000型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂。GM-221型高速冷冻离心机,上海市离心机械研究所。V-530型紫外/可见分光光度计,日本分光公司。
1.4 培养基
YEPD培养基(g/L)组成:葡萄糖20,酵母粉10,蛋白胨10,5.8~6.0;固体培养基在YEPD基础上加入15琼脂粉。液体种子培养基(g/L)组成:葡萄糖20,(NH4)2SO4 5.0,酵母粉0.5,KH2PO4 1.0,MgSO4*7H2O 0.5,pH5.8~6.0。限氮发酵培养基(g/L)组成:葡萄糖70,(NH4)2SO4 2.0,酵母粉0.5,KH2PO41.0,MgSO4*7H2O 0.5,pH5.8~6.0。以上培养基均在121℃下饱和蒸汽灭菌15min。
1.5 产油微生物的摇瓶培养
将新鲜斜面上长好的菌接种于50液体种子培养基中,于28℃,180/摇床培养20~24h。以10%接种量接种于45ml限氮发酵培养基中,在相同条件下摇床培养96h。发酵结束测定菌体生物量、油脂产量和残糖。
1.6 分析方法
1.6.1 菌体生物量测定
湿菌体于65℃烘24h至恒重,以干菌体/发酵液表示菌体生物量。
1.6.2 菌体油脂的抽提
湿菌体参照文献方法直接进行油脂抽提[5]。
1.6.3 残糖的测定 DNS法[6]。
1.6.4 残氮的测定 凯氏定氮法。
1.6.5 菌油脂肪酸组成分析
按文献方法对菌油脂肪酸进行甲酯化,样品利用GC9790气相色谱仪(浙江温岭福立分析仪器有限公司)分析,色谱条件如下:FFAP石英毛细管柱(30mx0.32mm,0.25um);进样器温度250℃;进样量0.5uL;载气N2 720ml/min,检测器(FID)温度250℃;H2 30ml/min,空气300ml/min;柱温120℃维持2min后以15℃/min升至150℃,再以5℃/min升至200℃维持5min[8]。脂肪酸通过对照标准样品定性,用面积归一法确定相对含量。
2 结果与讨论
2.1 产油能力初筛
产油微生物在培养基中碳源充足而某些营养成分(特别是氮源)缺乏时,菌体细胞分裂速度锐减,代谢活动转为以消耗碳源并合成和积累油脂为主。在油脂积累期,微生物基本上不再进行细胞繁殖,而是将过量的碳水化合物转化为油脂[9]。因此,培养基中碳、氮源浓度及C/N比是影响微生物油脂含量的主要因素。葡萄糖通常是菌体细胞生长和油脂合成的最适碳源,因此首先以葡萄糖为碳源,在限氮条件下发酵培养,对10株潜在的产油酵母菌进行初步筛选,试验结果见表2,发酵结束时所测得发酵液中的残氮很低,基本接近于零(数据省略,下同)。
由表2的摇瓶发酵结果可以看出,在组成简单的限氮培养条件下,未添加任何特殊营养成分,10株菌中有9株菌的油脂含量在20%以上,可初步确定为产油酵母菌[1]。6#菌油脂含量最高,达65.6%,脂肪得率系数9.5。其次是4#菌,油脂含量达42%。1#菌和11#菌虽然油脂含量只有30%左右,但其生物量和油脂量均很高,分别为18g/l和5.4g/l(1#)及26.6g/l和6.4g/l(11#)。同时,实验发现1#菌和11#菌耗糖速度很快,表明在限氮条件下仍然具有旺盛的代谢过程。
据文献报道,粘红酵母(R.glutinis)属产油菌株最高油脂含量能达到72%[1]。但本实验中,粘红酵母10#菌、12#菌和13#菌的油脂含量均在30%左右,菌体含油量偏低,这可能是由于菌种差异以及发酵条件差别所致,需在以后的实验中进一步研究。
脂肪得率系数是评价产油微生物经济性的重要指标,脂肪得率系数越高,表明菌体对底物的利用效率越好。根据油脂生物合成途径分析,理论上每100g葡萄糖可产生约33g甘油脂,即脂肪得率系数为33。由于部分碳源要用于合成其它非脂类物质,实际上脂肪得率系数很少超过22[10]。文献报道利用卷枝毛霉和高山毛霉研究产油真菌油脂合成的生物化学过程时,其油脂得率系数为5.5和13.3[11]。利用深黄被孢霉在高糖培养基中生产单细胞油脂,在不同浓度的初始葡萄糖的批式发酵中得出的脂肪得率系数分别为16.6~20.1[12]。从表2中可以看出,在没有进行培养基及培养条件优化的情况下1#菌、6#菌和11#菌脂肪得率系数较高,达到9.0以上,15#菌脂肪得率系数达到8.2。
2.2 利用其它碳源的产油实验
天然木质纤维素类生物质是由纤维素、半纤维素和木素三大部分组成。在许多植物体中半纤维素的含量接近或略少于纤维素。纤维素水解产物葡萄糖易被微生物利用,是常规发酵碳源。半纤维素主要是五碳糖的聚合物,水解产物以D-木糖和L-阿拉伯糖为主。许多微生物,如酿酒酵母,不能发酵约占原料8%~28%的五碳糖生产我们所需的产物酒精[13]。因此,高效利用半纤维素水解产物是工业微生物研究中的重要课题。我们参考文献方法进行了同化碳源实验,发现所选10株产油酵母对自然界所存在的主要六碳糖和五碳糖表现出广谱的同化能力[14]。
2.2.1 D-木糖发酵
我们重点考察了9株产油酵母在以D-木糖为唯一碳源,进行限氮摇瓶培养条件下产油脂的情况。由表3可以看出,产油酵母菌能发酵木糖在体内积累油脂。其中1#菌和11#菌,生物量超过20g/l,油脂含量在20%以上,表明这两个菌株在以D木糖为唯一碳源的限氮条件下仍然生长旺盛。4#菌表现出较低的生物量,但菌体油脂含量相对较高,达26.8%,脂肪得率系数也达到10.6;6#菌脂肪得率系数虽然也较高,但生物量和油脂含量都较低。利用D-木糖脂肪得率系数较高表明底物定向转化为油脂的效率高,对这些株菌有待于进一步地深入研究。
2.2.2 L-阿拉伯糖发酵
我们还以L-阿拉伯糖为底物进行了限氮摇瓶培养(表4),结果表明9株产油酵母都能利用L-阿拉伯糖并不同程度地积累油脂。其中1#菌油脂含量为24.9%,生物量为14.0/,脂肪得率系数9.0,进一步表明1#菌具有较宽的底物适应性。4#菌生物量较低,但脂肪得率系数达10.0,结果与2木糖相似。其它菌株对L-阿拉伯糖的利用能力均弱于对葡萄糖和D-木糖的利用。
2.3 油脂脂肪酸组成分析
产油微生物胞内积累的油脂以甘油脂为主,在脂肪酸组成上与一般植物油脂相似,仍以C16、C18系脂肪酸,如棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸为主[15]。其它脂肪酸,如亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)以及一些特殊脂肪酸则存在于一些变异株中。产油酵母利用不同糖发酵的油脂脂肪酸组成分析结果(采用面积归一化法进行计算)如表5所示。
在以葡萄糖为碳源发酵时,9株产油酵母菌油中棕榈酸含量在12%~37%之间,油酸含量在46%~72%之间,棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸和亚麻酸含量都比较低。这些产油酵母在利用木糖和阿拉伯糖发酵时,各脂肪酸相对含量变化范围较宽。以D-木糖为碳源发酵时,油脂中棕榈酸含量在12%~43%之间,油酸含量在40%~70%之间;以L-阿拉伯糖发酵时,油脂中棕榈酸含量在14%~40%之间,油酸含量在33%~72%之间。这说明各种属间利用不同单糖合成储存油脂的代谢调控机制可能存在着较大差别,值得深入研究。丝孢酵母6#菌利用木糖所产菌油中饱和脂肪酸(棕榈酸和硬脂酸)的含量超过了不饱和脂肪酸的含量。而1#菌和11#菌利用所有单糖为底物时所生成的油脂脂肪酸都相差不大,均以饱和及含单一不饱和键脂肪酸的甘油酯为主。另外粘红酵母(12#、13#)和圆红冬孢酵母(4#、15#)在利用单糖发酵产油时,还能形成一部分多不饱和脂肪酸,这些脂肪酸具有一定的保健功能和对某些疾病的治疗效果等,可用于开展研制具有高附加值的单细胞油脂。
总之,产油酵母利用单糖产生的菌油中以油酸为主,其次为棕榈酸和亚油酸。这3种脂肪酸约占总脂肪酸的90%以上。这表明油脂中脂肪酸链长相对集中,饱和度较高。在成品低芥酸菜籽油中含棕榈酸2.5%~6%、油酸50%~66%和亚油酸18%~30%,三种主要脂肪酸占总脂肪酸的85%左右,是目前生产生物柴油的重要原料油。从表5数据不难看出,本文筛选的这几种酵母菌的油脂在脂肪酸组成上和菜籽油非常接近,是制备生物柴油的潜在替代原料。
2.4 结 论
对10株潜在的产油酵母利用不同单糖产油脂能力进行了初步考察,6#菌(T.cutaneum AS2.571)在以葡萄糖为唯一碳源条件下,油脂含量达细胞干重的65%。脂肪酸组成分析表明,产油酵母所产菌油富含棕榈酸、油酸和亚油酸等饱和及低度不饱和长链脂肪酸,脂肪酸组成分布类似于植物油。其中1#菌(L.starkeyi AS2.1390)、4#菌(R.toruloides AS2.1389)、6#菌(T.cutaneum AS2.571)和11#菌(L.starkeyi AS2.1608)均能不同程度地利用木质纤维素水解液里的主要单糖(葡萄糖、木糖和阿拉伯糖)转化为油脂贮存在体内,具有在生物质转化过程中进行全糖利用的潜力。我们的筛选结果对进一步利用木质纤维素水解混合糖发酵提供了新思路。
产油微生物资源丰富、油脂含量高、能在多种培养条件下生长、可利用和转化废弃木质纤维素资源、保护环境,进行工业规模生产和开发有着巨大的潜力。微生物油脂通过与低碳醇进行转酯化反应可生产生物柴油,通过与多碳醇进行酯交换反应,可用于生产可生物降解的润滑油、溶剂油、油漆和油墨溶剂、表面活性剂、粘接剂等产品,高值化潜力大。部分菌油含有多不饱和脂肪酸,是生产具有高附加值单细胞油脂的重要原料。随着近年来生物科学和化学工程技术的发展,利用产油微生物对可再生资源进行高值化利用具有广阔的应用前景和可观的社会经济效益。
