1 引言
衣康酸又名甲叉丁二酸,有着广泛的用途。其可以作为合成塑料和橡胶的原料和辅助材料,也可以作为除垢剂,其除垢能力很好,同时衣康酸可作为高级化妆品的原料以及人造宝石材料等。目前,发酵生产衣康酸的原料普遍是蔗糖、葡萄糖、淀粉、糖蜜等。我们尝试了一种新方法,即以蔗汁为原料直接发酵生产衣康酸。这种新方法能大幅度降低生产成本,研究结果表明:取得较高的产酸率和较高的糖转化率。但不管采用何种原料,在菌种保存过程中,由于经过多次传代,衣康酸的产量都有不同程度降低。因此,寻找一种诱变方法,快速地恢复各株的高产量,是我们要解决的问题,其具有一定的应用价值。
2 材料与方法
2.1 菌种RH17(23)
本实验室筛选得的高产菌株(产酸率达6.83%)
2.2 培养基
(1)斜面培养基:7%蔗糖、0.4%(NH4)2SO4、0.4%MgSO4·7H2O、营养浆(加量1.6ml1000ml)、用H2SO4调pH4.0~4.5、2%琼脂、常规灭菌
(2)0.1%LiC1平板培养基:7%蔗糖、0.4%(NH4)2SO4、0.4%MgSO4·7H2O、营养浆(加量1.6ml1000ml)、0.1%LiCl、0.2%的溴甲酚绿(加量50ml1000ml)、用H2SO4调pH4.0~4.5、2%琼脂、常规灭菌
(3)摇瓶发酵培养基:(30ml装液量)10%蔗糖、0.1%MgSO4·7H20、0.25%NH4NO3、营养浆(加量4ml1000ml)、CuSO4·5H2O(加量0.004g1000ml)、用H2SO4调pH3.0、常规灭菌
2.3 诱变方法
出发菌株斜面℃——斜面活化——取活化斜面用15ml无菌生理盐水洗下孢子——转入无菌的带玻珠的250ml三角瓶中——35℃上摇床振荡活化——转入250ml无菌三角瓶中——10秒微波照射——吸0.5ml进行梯度稀释——取合适梯度涂平板。
2.4 筛选
挑平板上透明圈大的单圈落,上摇瓶发酵,测其产酸率,筛选高产菌株。
2.5 分析方法[2]
(1)衣康酸定性分析:纸层析法
(2)衣康酸定量分析:Friedkin溴化法
3 结果
在平板上挑取20个透明圈大的单菌落,测定其产酸率,数据如表Ⅰ:
采用C060和紫外线进行诱变,需挑取约100个单菌落,才可能得到1~2株高产菌株,有时还需多次诱变,采用逐步提高产量的方法,才能恢复菌种的高产量,上述方法费时、费力。
4 结论
从以上试验结果可以看出:经过微波育种,挑取20个单菌落,即可筛选得两株高产菌落,分别是微(6)6.85%和微(8)6.87%。因此微波育种是一种正变率很高的育种方法,对于提高衣康酸的高产量,是一种有效遗传育种方法。□
