柠檬酸是世界上以生物化学方法生产量最大的有机酸，也是一种重要的有机酸，在食品、医药、化工等领域应用十分广泛，世界年产量约 100 万吨。我国是世界柠檬酸主要生产国，年产能力近 50 万吨，占世界总产量的 40%以上。
目前，我国柠檬酸生产所用的菌株均为黑曲霉，大多经过多年的60 Coγ 射线或化学诱变剂等经典诱变手段的处理。对这些常规的诱变手段，菌种已具有较高的耐受性。因此，采用低能离子注入对黑曲霉进行诱变改良，具有重要的现实意义。
离子注入是材料表面处理的通用技术，上世纪80 年代，开始将离子注入技术应用于农作物品种改良并获得成功，由此开始了注入离子与生物体系相互作用过程的探索[l,2]。目前可大致将离子注入分为能量沉积、动量传递、粒子注入和电荷交换等四个反应过程。其作用机制较为复杂，很难用单一模式解释清楚。荷能离子注入除具有能量沉积引起机体损伤的特征外，还具有动能交换产生的级联损伤，表现为遗传物质原子转移、重排或基因的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤[2-4]。从离子注入的致死率曲线等可以看出，这种诱变手段在机理上有别于传统方法。低能离子注人具有生理损伤小、突变率高等特点，能取得较高的正突变率。本研究以 15keV N+对黑曲霉进行了诱变选育，并将低能离子注入技术应用于该工业微生物的改良。
1 材料与方法[5,10]
1.1 菌种
黑曲霉（Aspergillus niger），由江苏省连云港市德邦公司提供，本实验室在冰箱中冷藏保存。
1.2 培养基配制
1.2.1 斜面培养基
0.2（kg/L）马铃薯的煮汁，2%蔗糖，1.7%琼脂，115℃灭菌 30min。
1.2.2 普通培养基
0.2（kg/L）马铃薯的煮汁，2%蔗糖，1.3%琼脂，115℃灭菌 30min。
1.2.3 高葡萄糖平板
基本培养基中加 25%葡萄糖（葡萄糖需分消）。
1.2.4 高柠檬酸平板
基本培养基（4%琼脂）中加30%柠檬酸（柠檬酸需分消）。
1.2.5 稀土平板
基本培养基中加 0.3%稀土。
1.2.6 摇瓶培养基配制
玉米摇瓶培养基：0.20（kg/L）玉米粉调浆后水浴保温至 50℃左右，加入高温 α 淀粉酶和无水氯化钙，于水浴锅中加热升温至 90℃，并保持恒温 60min，至淀粉完全分解[6]，加入 0.06%的硫酸铵，定容，每 50mL 分装 500mL三角瓶中，115℃下灭菌 30min，备用。
木薯粉玉米粉混合摇瓶培养基：0.16（kg/L）木薯粉，0.04（kg/L）玉米粉，0.0067（kg/L）尿素，α 淀粉酶，蒸馏水，液化 30 min，定容，每 50mL分装 500mL 三角瓶中，115℃下灭菌 30min，备用。
1.3 培养方法
斜面培养：37℃，培养时间 5—7d。 发酵：500mL 三角瓶装入 50mL 培养液，115℃灭菌30min，接入孢子。摇床转速 300r/min，37℃振荡培养 64—72h。
1.4 诱变方法
黑曲霉（Aspergillus niger）经固体斜面培养基活化培养后，孢子成熟，用无菌水洗下新鲜孢子，振荡，使孢子充分分散，制成一定浓度的孢子悬浮液，备用。
用灭菌吸管吸取上述准备好的黑曲霉孢子悬浮液，滴于无菌的平皿中（液滴直径约 2mm），用涂布棒涂抹均匀，以无菌风吹至干燥，进行离子注入诱变。
离子注入机为 LZD900 多功能离子注入机。本实验用 15keV N+进行不同注量的离子注入，靶室真空度为 10- Pa。将平皿置于靶台上，以 5s 脉冲式3注入，间隔 15s。然后取出平皿，以 0.5mL 无菌水洗脱，涂分离平皿，于 37℃培养 2—3 d 用于单菌落的挑选和存活率的计算。
1.5 分析方法
1.5.1 pH 值测定
采用雷磁 PHS-3C 型精密pH计与精密pH 试纸相结合。
1.5.2 产酸测定
（1）酸度测定 发酵液经脱脂棉过滤后，用 0.1429mol/L NaOH 滴定，以酚酞为指示剂，用标准溶液滴定至淡粉红色，记录体积数。
（2）酸值 A（%）计算，A=K·V。式中，K=1－（失水量 /50），V 是碱液滴定体积数。
1.5.3 显微镜检查
显微镜型号 JNOEC XS-212-201，采用 10 倍放大。
1.5.4 存活率、诱变菌株产酸率增幅的计算
已照射菌株的存活率为其在固体平面培养基生长的菌落数与同样条件下生长的对照菌株菌落数的比值。
诱变菌株产酸率的增幅 =（诱变菌株的产酸率-对照菌株产酸率）/ 对照菌株产酸率。如增幅为于+5%— -5%，为无义突变；低于-5%，为负突变；高于+5%，为正突变。
1.6 筛选方法
1.6.1 初筛
在培养平板上进行。将经离子束注入后的平板用无菌水洗下，涂布于普通平板和筛选平板。挑选在普通平板上菌落较小且比较紧密的菌落，以及能在筛选培养基上生长的菌落。把这些菌落转接到斜面上进一步筛选。
1.6.2 复筛
将初筛获得的菌株转入发酵培养基逐个发酵，进行产量测定。
2 结果与讨论
2.1 菌株的发酵动力学分析
选择 CK1-16 菌株为发酵菌株，采用玉米发酵培养基中的最佳培养基配方，进行发酵动力学分析，测其柠檬酸产量变化曲线，pH 值变化曲线及镜检情况如图 1 所示。
由图 1 所示， 柠檬酸菌株 CK 1-16 产酸率在发酵 67—69h 达最高点，最终 pH 值略低于 2.0。柠檬酸发酵高产时，在显微镜下可以看出，黑曲霉菌丝球多、球体小而紧密。相反，菌体大或生长过旺而产生菌丝体时的产酸率都不高。
2.2 存活率曲线
以菌株CK1-16为原始出发菌株进行15keV N+注入诱变，注量分别为 31×10 13、103×10 13、192×10 13 和 258×10 13/cm2。照射后存活率曲线如图 2 所示。
图 2 显示，对于 15keV N+，离子注入注量小时菌株的存活率较高，注量增大存活率呈下降趋势，但在 192×10 13 /cm2附近，存活率有短暂回升，整个存活率曲线呈马鞍形。该离子的射程较短，低注量时离子只对细胞表面进行损伤和刻蚀，菌体存活率较高。随注量增加，细胞表面刻蚀严重，离子损及细胞内部并产生大量自由基和软射线等，致使存活率急剧下降。但下降到一定值时，细胞某种修复机制、修复酶被激活，诱导产生锰-超氧化物歧化酶的催化（ Mn-Superoxide dismutase catlysis ，Mn-SOD.CAT）活性升高，存活率又有所回升[2]。当剂量上升到一定程度，聚集于细胞表面的电荷产生库仑爆炸，使细胞失去了电荷屏蔽，存活率急剧下降。
2.3 诱变注入注量与突变率关系
表1数据为三次重复实验的平均值。由表1可见，258×10 13/cm2注量的正突变率最大，达 71.4%，故可在此剂量附近范围继续进行诱变。
2.4 诱变菌株的遗传稳定性研究
经发酵试验，这些突变菌株的产酸增幅最大者达 17%。同时，也进行了诱变后高产菌株的遗传稳定性研究，以筛选出稳定、高产的菌株。遗传稳定性考察的每代实验过程为：高产菌株单菌落→斜面→摇瓶发酵→测柠檬酸产量。
在木薯粉玉米粉混合摇瓶培养基实验中，得到一株遗传稳定性较好的高产菌株4#-8-1，共传4代，其71h 产酸结果见表 2，其平均产酸增幅为14.2%。
在以玉米粉混合摇瓶培养基中得到两株遗传稳定性较好的高产菌株 4#-8-7 和 4#-8-8 各传4代， 64h产酸结果见表 3。其平均产酸增幅分别为 15.9%和 17.0%。
由表 2 和表 3 可以看出，突变得到的这三支菌株遗传稳定性较好。它们性能稳定，平板培养基上菌落气生菌丝短，孢子较粗壮，颜色稍浅，无退化现象，在摇瓶培养基中菌球小而紧密。这三支菌株均为 258×10 13 /cm2注量的突变株。
3 结论
15keV N+注入柠檬酸生产菌，筛选到三株高产突变菌株，与出发菌株相比，其产酸性能提高了约17%。以 0.16（kg/L）木薯粉与 0.04（kg/L）玉米粉混合液为发酵液，其柠檬酸产量达到 16.04%左右。以 0.2（kg/L）玉米粉滤液为发酵液，其柠檬酸产量达到 9.53%左右。目前该高产菌株及相关发酵条件已在德邦公司进入 100t 大罐的工业化生产实验阶段。
本文研究了 15keV N+注入黑曲霉的生物学效应，获得了高产突变株，可为工业微生物的遗传改良提供借鉴。
