有关MgC1z对黑曲霉柠檬酸发酵的影响研究报道很少，M．Rohr等曾研究过ATP-Mg螯合物对柠檬酸正常供氧条件下的影响，他们认为Mg"在黑曲霉胞内与ATP一螫合，使ATP产生的抑制作用减弱。但迄今为止，国内外尚无Mgcl：对黑曲霉柠檬酸发酵过程中断氧影响的报道，黑曲霉柠檬酸发酵代谢过程中，氧是柠檬酸合成中的一个观念上的底物，它参与了EMP途径及丙酮酸脱氢过程中生成的NADH重新氧化，因此，氧成为柠檬酸发酵过程中重要的调控因素。在黑曲霉柠檬酸工业发酵过程中，由于停电等原因会出现发酵过程中的突发性断氧现象。据报道发酵旺盛期突发性断氧，即使l～2min也会使发酵周期延长十几小时甚至1～2d，对工业化生产造成很大损失。
本文在研究正常供氧条件下Mg2+对黑曲霉柠檬酸发酵影响的基础上，研究了发酵旺盛期断氧及MgC12对黑曲霉的影响。
l材料与方法
1．1菌种
黑曲霉(Aspergillus．niger)UC一76，本研究所选育收藏。
1．2培养基
斜面培养基：察氏培养基。
发酵培养基A(空白对照培养基)：淀粉水解液l3～l5(总糖)，麸皮1．5～2．0，pH6．0。
发酵培养基B：Mga0．02～0．20mg／L，其余同培养基A。
1．3主要仪器
高压液相仪HPLC-168；DU一650分光光度计均为Backman公司生产；HZ一88IS恒温振荡器江苏太仓实验仪器厂；光学显微镜NikonHB-101OAF．．1ap,art等。
1．4分析方法
总酸度测定：NaOH滴定法。
柠檬酸及杂酸测定：HPLC测定]。
还原糖测定：裴林试剂法]。活体染色计数：棉蓝乳酚油染色【后血球板计数。柠檬酸合成酶酶活测定：按Dixon~的方法测定，菌丝体破碎在0～4℃下操作
1．5实验方法
1．5．1摇瓶正常供氧发酵
将培养5～7d的新鲜斜面用无菌水于容量瓶(5OmL)制备孢子浓度为10～10个孢子／mL的悬浮液。分吸1mL孢子液接种，A、B两种发酵培养基摇瓶(均为250mL)的最终装填量为50mL，纱布6层。(364-1)℃，250r／mi~，恒温振荡培养70h，间隔取出平行摇瓶进行糖度、酸度及菌体浓度的测定。
1．5．2摇瓶断氧试验
按1．5．1方法接种A、B两种培养基摇瓶，在发酵旺盛期进行30rain断氧，断氧结束后重新启动振荡器，温度、转速不变，对断氧前后的平行摇瓶进行酸度、菌体浓度及酶活的测定。
2结果与讨论
2．1正常培井条件下两类发酵摇瓶产酸及生物量比较首先，在正常供氧情况下，我们选择了Mgc1：6个不同的浓度水平与空白一起进行发酵实验，发酵70h后对酸浓、糖浓及菌体浓度进行测定，结果表明：在初始接种量相同的条件下，Mgc1浓度在0．08～0．15mg／L之间对产酸率表现出一定促进效应，与未加入Mgc1空白摇瓶产酸对照产酸率提高4～7(表1)。我们将空白摇瓶及0．1mg／LMgC1z摇瓶发酵过程中的酸度及活菌浓度(c)进行了检测(图1)。在正常供氧条件下，0．1mg／LMgC1z对活菌浓度的影响并不显著。
由于Mg一对黑曲霉代谢途径中的多种酶的酶活具有调节作用，我们采用HPLC分别对两类摇瓶发酵的杂酸等副产物进行了检测(图2和图3)。0．1mg／LMgC1z并未引起草酸及异柠檬酸浓度的升高．未知杂峰数也没有增多。柠檬酸对葡萄糖转化率为89．2。空白摇瓶的转化率为86.8。
2．2发酵旺盛期断氧实验结果及讨论
由图l可以看出．摇瓶的柠檬酸发酵旺盛期在20~50h，我们选定发酵30h进行断氧实验，断氧时间30rain，断氧30min后恢复供氧，振荡速度仍为250r／min，发醇70h后结束。结果(见图4)与正常供氧条件下空白摇瓶的产酸数据进行比较，发现断氧30min的空白摇瓶70h产酸6．20，产酸率下降56．8，添加0．1mg／LMgc1的断氧摇瓶产酸10．5I，产酸率下降16．2。尽管在正常供氧条件下，0．Img／LMgc1对黑曲霉产酸有一定促进效应，单位菌体量的产酸速率(产酸量／时间·菌浓)有所增强，却不足以说明断氧条件下造成下述产酸的差异。为此我们对断氧后摇瓶抽样进行了活体计数(图4)，并对黑曲霉柠檬酸合成酶Ec4．1．3．7]活力进行了检测(表2)。结果发现在断氧30min后，空白摇瓶菌体存活率仅为21-7，而柠檬酸合成酶比活力相差不大。
断氧后31h取样镜检发现空白摇瓶菌体大量死亡自溶并吸附缠绕成团状，断菌丝多(图5a)。0．1mg／LMgCl：摇瓶的镜检虽然也发现上述情形．但所聚集的菌体数量明显减少(图5b)，且以单个球状体存在的菌体比空白摇瓶中的多，但该类菌体(图5c)与重新供氧20h后再繁殖的菌体(图5d)差异明显。这主要是由于断氧对菌体微细胞结构的影响及衰老固素造成的。进行活体染色表明，该类菌体具活性，固此可认为它们仍有一定产酸能力。根据上述实验，我们认为断氧后0．1mg／LMgCI2对菌体产生激活作用，提高了菌体存活率，从而造成了上述两类摇瓶产酸的显著性差异。有关这方面机理性的研究多集中于动物细胞，金基焕等研究了ATP—MgC1z心脏冷停搏保护液对缺氧心肌的保护作用，他们认为细胞在断氧时，ATP会降解为AMP和腺苷等，从而导致次黄嘌呤的堆积，当恢复供氧时+上述物质在氧化酶作用下产生大量氧自由基(o1)。同时+由于断氧内源性SOD过氧化氢酶(CAT)等物质浓度下降，不足以清除氧自由基从而导致细胞的损伤、死亡。ATPMgCI：可以有效地清除氧自由基从而对缺氧心肌产生保护作用。杨福愉等【?研究了Mg对重建脂酶体上猪5-线粒体H一ATP酶(ATP合成的关键装置)构象的影响。研究表明Mg2一，提高了重建H十_ATP酶的活性。由于Mg的存在改变了膜脂的物理状态及酶的构象+他们认为这可能是因为Mg影响重建体系脂质分子的流动性。从而使H一ATP酶具有较合适的构象呈现较高的活性。Mgelz与黑曲霉胞内ATP结合及其对线粒体内的柠檬酸代谢过程是否产生影响需作进一步探讨。
