陈国强
(清华大学 生物科学与技术系 北京 100084）
摘 要：聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate简称PHA）, 一种由微生物合成的聚酯，由于具有生物可降解性、生物相容性、压电性等许多优良性能，可能在众多领域，如生物降解性包装材料、组织工程材料、缓释材料以及电学材料等方面得到广泛应用，因此正引起了科研领域和工业界的广泛兴趣。本文对PHA的物理、化学性质以及其分子领域的研究进行了综述，特别是本实验室近期取得的一些研究进展，包括：应用傅立叶红外光谱直接快速筛选出对PHA生产菌；利用一株假单胞菌Pseudomonas stutzeri1317进行分子设计，合成多种新型PHA，可以期望得到满足要求的材料；一种快速PCR克隆II型PHA合成酶基因方法的建立，并应用此方法从不同菌株中分离出4种新的PHA合成酶基因；首次发现3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚物(Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)，简称为PHBHHx)作为生物材料具有比聚乳酸更好的生物相容性；应用微生物法生产手性羟基脂肪酸（HA）单体的研究；以及应用二维红外技术对PHA的预熔状态进行研究等等。
关键词：聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate或PHA），聚羟基丁酸（PHB），PHA合成酶（PHA synthase），聚酯 （Polyesters）
1.PHA概述
1.1 PHA—微生物合成的多种单体的聚合物
聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate 或 PHA）是很多细菌合成的一种细胞内聚酯，在生物体内主要是作为细胞内碳源和能源的贮藏性物质而存在的[1,2]。到目前为止已有约80种不同的脂肪酸作为PHA的单体在约300种细菌中被发现[3]，这些结构单元的碳原子数从3到14之间，有饱和或不饱和的侧链、脂肪族以及芳香族聚侧链等等[2]。
1.2. PHA在细菌中的积累是自然界中一种普遍现象
目前认为PHA在细菌中的积累是自然界一种普遍存在的现象[4]。已有超过九十个属的细菌被发现可以合成超过150种以上不同结构的PHA[5]。
根据PHA单体组成的不同，通常把合成PHA的微生物分成三类：（1）合成短链PHA（short-chain-length PHA 或sclPHA）的菌，其代表是Ralstonia eutropha（以前叫Alcaligenus eutrophus）[1]，其合成的PHA的单体由3-5个碳原子组成；（2）合成中长链PHA（medium-chain-length PHA或mclPHA）的菌，以Pseudomonas oleovorans[1]为代表，其合成的单体由6-14个碳原子组成；（3）近年来报道有不少菌株可以同时合成两种单体，虽多数以共混形式存在[4,6]，但已有报道某些菌株可以合成短链与中长链共聚脂肪酸酯[7]。
1.3.PHA的鉴定及检出方法
无论从哪个角度研究PHA，都需要有一个简单，快速的方法对其性质和含量进行检测。随着PHA研究的不断发展，对PHA进行检测和分析的方法越来越多。
早期用于定性研究胞内PHA存在的方法是染色法[8]，其缺点是灵敏度不高。核磁共振法（NMR）可检测PHA单体结构及单体间是否共聚，但分析时间较长，结果分析比较复杂[9]。高压液相色谱法（HPLC）主要应用于测定PHA聚合物的分子量、聚合度及单体排列顺序等[10]。另外还有偏光显微镜、X射线及电镜法被用来研究PHA的结晶形态[11,12]。
本实验室建立了傅立叶红外光谱（FT-IR）分析方法。在细胞水平上直接对细菌内PHA进行定性和半定量分析。细菌的平板菌落或液体培养物离心后得到的细胞均可用FT-IR检测出PHA的有无、类型及相对含量[6,13]。含PHA的样品在FT-IR光谱中1735 cm-1附近有一个PHA的羰基特征峰，该峰的出现与否对应了样品中是否含有PHA，而该峰的形状和峰位则反映了PHA样品的结晶程度。不同的PHA由于其侧链长短的差异导致样品具有不同的结晶程度，故根据单体碳原子数的多少其羰基峰的位置也略有不同，在样品充分结晶的情况下分别为：短链PHA（如PHB）在1728 cm-1左右； 中链PHA（如PHO、PHD）在1740 cm-1左右；含短链和中链单体的PHA，特征峰对应为1732 cm-1左右。另外，在1280 cm-1和1165 cm-1附近还有伴随谱带出现，在2925 cm-1附近有一甲基或亚甲基的谱带，它们也被用来帮助确定PHA的结晶形态和类型。研究还表明，PHA在胞内状态下，其羰基峰会不同程度地发生峰位移，而其他伴随峰依然存在[6]。
在此基础上，本实验室还建立了利用新型二维傅立叶红外光谱学技术（2D FT-IR）研究PHA的物化特性的方法，首次将2D FT-IR技术系统地引入PHA的研究中[14-16]。首先，2D FT-IR方法简便直观地显示了半结晶状态的PHA样品在升温熔融过程中的预熔现象：在热扰动下，样品中晶态结构的消失与完全不定型态的增加这两个事件不是同步发生，在晶态向不定型态转变的过程中需经历一个中间状态，这个中间态的存在即是PHA熔融时的预熔现象 [14,15] 。 另外，我们还通过2D FT-IR技术研究了在单体组成不同的扰动下两种PHA共聚物（PHBV和PHBHHx）的显著不同的结晶过程。研究表明，对于PHBHHx，HHx成分不能参与结晶，且影响了由HB成分构成的晶体结构的大小，总体上降低了共聚物的结晶度；而PHBV由于HB和HV单体具有的同二晶现象，HV成分的加入没有改变共聚物的结晶性质，故PHBV始终保持了比较高的结晶度[16]。
2. PHA的应用
2.1. PHA--生物可降解塑料
PHA的应用是材料科学与生物科学相结合的一个新的领域。PHA首先是作为一种由微生物合成的性能类似于聚丙烯的可降解“塑料”而引起人们关注的，所以它的应用范围包括与塑料有关的领域，即可抛弃型的塑料用具，如包装膜，手袋，容器等。
PHB在某些性能上类似于热塑性塑料，其某些力学性质与聚丙烯相似。但是PHB的化学结构简单规整，因而性脆，断裂伸长率很低，且PHB的热加工性不好[1]。其它单体的插入会显著地改善PHA的性能并带来一些新的特性，如HV(3-羟基戊酸)单体的掺入使得HB和HV单体的共聚物PHBV的结晶度下降，相应的硬度下降但强度上升，韧性增强；且PHBV的熔点随着HV单体浓度的增加而下降，但其分解温度却没有同步下降，因此相比于PHB，PHBV的物理和加工性能大大提高了[1]。最近的进展表明，由本实验室开发成功并已经可以大规模生产PHBHHx共聚物是一种具有更好性能的聚合物[17]。
2.2. PHA在组织工程中的应用
PHB是最早被应用于骨折固定材料的PHA，但由于单纯PHB易碎、热不稳定、降解时间长、可塑性和机械性能差等缺点限制了它的广泛应用。 将3-羟基戊酸(3HV)引入PHB主链，形成PHBV共聚物，由PHB和0～24%PHV组成，可改善PHB的上述缺点[18]。原则上，PHA的各种物理化学和生物性能能够满足多种人种组织器官的需求，如：心血管系统、角膜胰腺、胃肠系统、肾脏、泌尿生殖系统、肌肉骨骼各系统、神经系统、牙齿与口腔、皮肤等等[19]。目前已经能进行商品化生产的PHA产品如PHB、PHBV和PHBHHx [17,20]已经证明具有生物相容性[19,21]。
特别要引起注意的是，我们在研究中发现，PHBHHx作为PHA家族的新成员，其作为组织工程材料，具有优于PHB和传统聚乳酸（PLA）的细胞相容性[21]。另外在膜的改性研究中还发现，脂肪酶是一种比较理想的表面改性和提高细胞相容性的试剂，本实验室并首次报道了脂肪酶对PHA膜表面细胞相容性的影响，发现用酶处理后的PHB和PHBHHx在生物相容性方面都有显著的提高[21]。
2.3. HA—良好的手性化合物
由于单一手性的药物具有安全性高和使用剂量小等巨大优势[22]，因此对手性单体的研究越来越多。PHA作为微生物合成的胞内生物聚合物，其组成的单体都是具有手性的[3,23]。3-HB是最常见的PHA单体，在第三个碳原子上具有一个手性中心，存在两种光学异构体(R)-(-)- 和(S)-(+)-构型。绝大多数已知的PHA都是由(R)-(-)构型的HA单体聚合而成的，因而可以先合成一些带复杂官能团的聚酯，再通过降解得到带手性的单体，然后利用这些单体来合成一些具有生物活性的复杂衍生物，在制药、化妆品等行业得以应用，如可以用来合成抗生素、维生素和信息素等化合物[24]。
2.4. PHA在其他领域的应用前景
PHA作为一种自然界存在的高分子材料，可能在很多领域都有着潜在的应用前景[1,2]。由于在许多高等生物体内都发现了PHB的存在，因而可以利用它的生物相容性作为医药材料，如包裹药物，进行药物的定量定向释放等；另外，由于mclPHA合成菌可以把官能团掺入到PHA分子中，所以可以利用这些PHA合成菌通过设计培养基的底物来进行分子设计以合成一些无法用人工方法合成的具有生物活性的高分子材料[25]，预计可在非线性光学材料领域得以应用[1,2]；对PHA的深入研究还表明 PHB具有压电性，因此也有可能在光电子材料领域能够得以应用[1,2]。
虽然人们已经了解到PHA具有大多数生物材料所不具有的非线性光学性能以及压电性等可应用于高附加值参产品中的性能[1,2]，但对这些方面的应用和开发还几乎是空白，所以加强这些方面的研究就显得尤为重要，因为对它们的研究不仅可以拓宽PHA的应用，而且也会促进人们对PHA及PHA在生物界中作用的认识。
3. PHA的生产
3.1. 用于生产PHA的野生型菌株
很多野生菌在被发现能够合成PHA后，即被用来进行大规模生产[26-29]。本实验室在长期的菌种筛选及发酵研究中，发现了许多优良的PHA生产菌[5,30-38]，其中如Pseudomonas stutzeri1317甚至可以合成一些不常见的PHA [30,36,38]。
尽管已经发现多种野生微生物可以合成PHB，但只有R. eutropha, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii和几株甲烷菌[2,20]能够以高浓度和高产率来生产PHB。本实验室首次开发成功了利用Aeromonas hydrophila生产PHBHHx的工业化技术[17]。
不过，作为生产用PHA菌种应该具备可以利用便宜的碳源、生长迅速及易于操作提取PHA等特点，因此许多野生菌种很难适合用于工业化生产。为了达到商业化的目标，包括改良菌种、优化发酵和提取工艺等在内的一系列研究和努力正在被用来降低PHA的生产成本[2,20]。
3.2. 用改造的生物工程菌株生产新型PHA
3.2.1. 与PHA代谢相关的酶
PHA在生物体内的合成、保持和降解是在许多酶蛋白的作用下，由多条代谢途径参与的复杂过程。与PHA代谢相关的酶大致包括与PHA生物合成有关的酶、与PHA颗粒结合的辅助结构蛋白、PHA降解酶。以及一些与PHA合成相耦联的途径中的相关酶。在这些蛋白中，PHA合酶是PHA合成的关键酶，决定着PHA的类型，如短链、中长链或者它们的共聚物。第一个被克隆的PHA合成酶来自R. eutropha[39]。到现在为止，至少40个不同的PHA合成酶基因被从约40种不同的菌种中用不同的技术克隆出来[40]。
本实验室建立了一种新的简单的PCR克隆技术 ，而且从一些本实验室以前筛选出来的假单胞菌中克隆出来许多新的二型PHA合成酶基因[41]。此方案利用了PHA合成基因区域的保守区域，可以被用于大多数假单胞菌。应该注意的是，PHA合成酶与GenBank中其它的蛋白质家族没有明显的同源性，不过根据他们的一级结构和底物特异性，PHA合成酶组成了一类高度同源的蛋白酶[40]。
3.2.2. PHA前体合成途径
在PHA合成途径的研究中，R. eutropha 的P(3HB)合成途径是最早并研究得比较透彻的。最近在中心代谢途径与PHA合成之间发现了一些新的联系，包括利用合成或者降解代谢途径来合成HA-CoA或者将代谢流向导向相应的HA-CoA的合成[2,3]。另外，新近的研究还发现这两种途径与PHA合成途径相联系：PhaJ和FabG将脂肪酸b-氧化的中间产物转移到PHA合成上去[40]，而PhaG和FabD将脂肪酸从头合成途径的中间产物转移到PHA合成[40]。以前的研究表明在PHA合成中这两条脂肪酸代谢途径是各自单独起作用的[1],不过，最近的研究发现这两条途径之间也有联系，可以将脂肪酸从头合成途径的中间产物酰基-ACP在一个硫酯酶的作用下转变为降解途径的中间产物酰基辅酶A[40]。这个新发现表明PHA合成的单体提供途径是很多样化的，而对PHA合成进行代谢工程的研究也有更多的选择。
3.2.3. 利用重组大肠杆菌生产PHA
自从R. eutropha的phbCAB操纵子在重组E. coli中成功地表达合成PHB以来，PHBV、PHBHHx和P3HB4HB，甚至中长链mcl PHA都已经在野生或突变大肠杆菌菌种中通过异源表达技术得以合成[39]。
E. coli作为一种模式生物系统，不但可以研究PHA合成的不同基因和代谢途径，还可以提供一种容易理解的生理环境，用来利用不同的代谢途径从便宜的碳源中生产不同组成的PHA。利用E. coli生产PHA的另一个好处是由于它本身不能合成PHA，所以没有胞内PHA降解酶，这样就可能可以生产出高分子量PHA。
3.3. 用代谢工程的方法得到更多的PHA合成者
从简单而便宜的碳源中生产出具有更多不同单体组成的PHA对其广泛应用是非常重要的，在这种意义上，CO2是最理想的碳源。有的研究把酵母、蓝藻、植物和昆虫细胞作为PHA潜在的生产者并获得了成功[39]。出于经济考虑，植物和蓝藻是最有可能的候选者。在不久的将来，PHA就可能不是被生产出来，而是从转基因植物中被收获了[39]。
3.4. HA单体的生产
常规合成3-HB的方法是化学合成，其缺点是很难将其两种不同的手性构型分离开来。近几年来，发展出了由聚合物PHB在体内由降解酶直接降解或者体外酸解[42]为3-HB的方法。这些方法用化学或者酶的方法将微生物合成的PHB降解为单体，由于PHB的光学均一性，降解得到的单体都是具有光学活性的，为HA的获取开辟了很好的途径。
本实验室采用微生物工程方法可直接、连续地合成出手性HA单体。吴琼等将R. eutropha的phbAB基因导入E. coli中，获得了HB单体, 并使表达量达到1 g/L以上[43]。张广等利用P. putida的PhaG基因，将脂肪酸从头合成途径直接与PHA生物合成相耦联，成功地利用重组大肠杆菌合成出了手性单体(R)-3-HB 和(R)-3-HD[待发表结果]。这些方法都为手性单体的生产提供了新的思路。
4. 小结与展望：代谢工程合成新型PHA
随着人们对PHA合成生化过程了解的不断深入，以及越来越多的PHA合成酶基因被从各种不同的菌种中克隆出来，使得通过代谢工程策略调控PHA的生产成为可能。通过代谢工程策略，人们将可以对PHA的生产菌株及非生产菌株在以下几个方面进行调控：1.加强PHA的合成能力；2.扩大可利用的底物的范围；3.生产新型的PHA。要想获得上述这些乐观的结果，必须对代谢途径进行深入的分析及合理的设计。在不久的将来PHA生产菌的代谢途径将可以应用数学模型进行数量描述及物流分析。这种基于模型的方法将可以帮助我们建立和选择PHA生产的最佳代谢途径的策略，PHA生产菌株细胞工程的发展将大大加快下游PHA纯化的效率。在不久的将来，人们将可以按照自己的意愿大量生产满足各种需要的、具有环境相容性的聚酯—PHA。
致谢
本工作受到国家自然科学基金的支持（基金编号20074020和30170017），在此致谢。
参考文献（略）
