ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是由微生物合成的L-赖氨酸同聚物,由-氨基与α-羧基通过肽键连接而成,其聚合度一般为25～35[1,2]。ε-聚赖氨酸具有抗革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒的活性,是一种性能优良的生物防腐剂。除外,还用作化妆品、基因载体、药物包被物、电子材料和环保材料。在日本,ε-PL已作为食品防腐剂进入商品市场,国内对ε-PL研究刚刚起步。目前生产及研究的可发酵产ε-聚赖氨酸的菌主要是白色链霉菌(Streptomycesalbulus),其它菌少有报道。本文从土样中筛选ε-PL产生菌,对其中ε-PL高产菌株PL6-3株进行了形态、生理生化和系统发育学研究。
1 材料与方法
1.1 ε-聚赖氨酸产生菌的筛选
1.1.1 土样:南京市郊紫金山、栖霞山、中山植物园及市郊水稻田、菜地等处采取。
1.1.2 培养基:
(1)分离培养基(SG培养基):甘油10g,琼脂15g,酵母膏0.1g,NaH2PO40.68g,MgSO4·7H2O0.25g,(NH4)2SO40.66g,140mL痕量矿物溶液,定容至1L,pH7 0。1×105Pa灭菌30min。
(2)检测培养基(SGB培养基):SG培养基加美蓝0.002%。1×105Pa灭菌30min。痕量矿物溶液:NaCl1g,FeSO4·7H2O 0.1g,CaCl2·2H2O 0.1g,明矾0.01g,CuSO4·5H2O 0.01g,CoCl2·6H2O 0.1g,H3BO30.01g,ZnSO4·7H2O0.1g,NH4Mo7O24·4H2O 0.01g,定容至1L。
(3)复筛培养基:参照文献[2]。
1.1.3 SG培养基中抑制剂重铬酸钾(K2Cr2O7)浓度的确定:土样在室温下自然风干10d后,系列稀释后涂于平板,培养基中抑制剂的浓度为0～500mg/L。根据计算平板上的放线菌、真菌和细菌的菌落数确定添加抑制剂的浓度。
1.1.4 菌株分离步骤:土样于室温下自然风干3～10d,碾碎过筛。50℃烘1h,取1g土样加入10mL灭过菌的5mmol/L磷酸缓冲液中(pH7 0,其中含蛋白胨6%和SDS0 05%),50℃振荡10min。适当稀释后涂布于添加K2Cr2O7的SGB培养基,28℃培养3～7d。挑取形成透明圈的单菌落接于SG培养基中,培养7d,挖取菌落周围琼脂块,用Dragendorff试剂检测,取Dragendorff反应呈阳性菌株进行复筛。
1.1.5 复筛菌株产物的提取和纯化:取一环孢子接种到50mL复筛培养基的500mL三角瓶中,28℃培养3d。参照文献[3]提取纯化产物,得到ε-PL样品,进行分析。
1.2 分析方法
1.2.1 ε-PL的测定:参照文献[4]。
1.2.2 产物酰胺键连接方式的确定:参照文献[5]。
1.3 菌株鉴定
1.3.1 形态与培养特征鉴定方法:参照文献[6～7]。
1.3.2 生理生化特征:参照文献[6～8]。
1.3.3 细胞壁化学成分的分析:参照文献[9]。
1.3.4 16SrDNA全序列分析:取鉴定菌株幼龄培养物,采用华舜细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。设计其16SrDNA特异引物如下:正向引物:5-CGTGCTTAACA CATGCAAGTCGAAC-3',反向引物:5-AGCAATGCTGATCTGCGATTACTAG-3'。引物由上海博亚生物有限公司合成。进行PCR扩增后,所得产物由上海博亚公司进行测序。所得的16SrDNA序列与GenBank数据库中相关种属的序列比较,确定该菌株的分类地位。
2 实验结果
2.1 产ε 聚赖氨酸菌株的筛选
2.1.1 SG培养基中重铬酸钾浓度的确定:重铬酸钾能明显抑制土壤中真菌、细菌,而对放线菌无抑制作用,可选作分离放线菌的一种高效、便宜的抑制剂。经试验确定K2Cr2O7的用量为150mg/L为宜。
2.1.2 产碱菌株的筛选:美蓝可以和微生物分泌出来的碱性聚合物在平板上形成独特的菌落圈。如图1所示,可以分泌ε PL的PL6 3菌株在SGB培养基中培养一周后,菌落周围的美蓝被排斥而形成了一个透明圈,而透明圈边沿美蓝的浓度明显增大,颜色加深,不产ε-PL的则没有透明圈的形成,据此可以很灵敏地把产碱菌筛选出来。每个平板(11cm)可以同时检测200个菌株,大大减轻传统筛选方法的工作量,实现高通量筛选。用该法从土样中共筛选得到219株产碱菌。
2.1.3 产生物碱菌株的确定:ε-PL是一种生物碱,可利用Dragendorff试剂进行检测。219株菌中只有46株为产生物碱的菌株,其中173株菌产物中均未检测到生物碱的生成。
2.1.4 产ε-PL菌株的确定:对分离得到的46株生物碱产生菌进行摇瓶发酵,比色法测定ε-PL含量。有4株菌摇瓶发酵生成较高浓度ε-PL,结果示于表2。对PL6-3菌株提纯后的产物进行分析,产物[α]D25=+57.1(c=1 in H2O)。酸水解液中只有赖氨酸,无其它氨基酸,说明产物为赖氨酸同聚物,采用Sanger法测定其酰胺键连接方式为ε-结构(图略)。以上分析证明产物为ε-PL。
2.2 ε-PL产生菌株的鉴定
2.2.1 形态与培养特征:PL6-3在高氏一号琼脂上生长中度,孢子丝呈波曲状或松柔旋,在电子显微镜下孢子长椭圆形至椭圆形,大小差别较大。培养特征见表3。
2.2.2 生理生化特征:菌株PL6-3能以多种物质为唯一碳源生长如葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、棉籽糖、甘油。菌株可快速液化明胶、水解淀粉、胨化牛奶但不凝固。不利用纤维素,不产生H2S。能耐受3%的NaCl,产黑色素,不产几丁质酶。
2.2.3 细胞壁化学组分分析:PL6-3菌株的全细胞水解液中含有LL-DAP,meso-DAP;糖成分有鼠李糖和葡萄糖。
2.2.4 16SrDNA全系列的相似性比较和系统发育分析:所测菌株PL6-3的16SrDNA核苷酸序列为1,227bp。将所测序列从GenBank数据库中的相关种进行比较,构建以16SrDNA全序列为基础的系统发育树(图2)。结果表明:菌株PL6-3与北里孢菌属(Kitasatospora)同源性都很高。如菌株PL6-3与K.recifensis同源性为98.8%,与K.kifunensis同源性为98.9%,与K.sp.C2同源性为99.3%。结合形态、细胞化学成分及16SrDNA全序列分析的系统发育研究结果,可以将菌株PL6-3的分类地位确定至属的水平,即:菌株PL6-3属于北里孢菌属,并且与北里孢菌变种C2(K.sp.C2)具有高于99%的16SrDNA序列相似性。
3 讨论
本文建立了一种灵敏的ε-PL产生菌高通量筛选方法。通过土样处理和美蓝“筛子”,筛选到219株产碱菌株;利用Dragendorff试剂检测到46株生物碱产生菌;复筛得到4株ε-PL产生菌,其中一株PL6-3菌摇瓶发酵产0.41g/Lε-PL(发酵优化尚待进行)。经菌种鉴定PL6-3属北里孢菌,但种水平上的鉴定还待进一步工作。
致谢 中国科学院微生物研究所刘志恒和黄英老师提供DAP标准样并对实验结果提供宝贵意见,特此致谢。
